細胞特異性核酸適配體在疾病治療中的應用

鐘朝濱 朱龍佼 張博洋 張洋子 陳可仁 許文濤

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 中國農業大學營養與健康系 食品精準營養與質量控制教育部重點實驗室，北京 100083）

研究人員于1990 年發現了核酸適配體，證明與結合靶標具有高親和力的核糖核酸（RNA）可以從一個大的RNA 文庫中篩選出來［1］。隨著研究的進展，發現了越來越多類型和數量的核酸適配體。核酸適配體可以特異性地結合到靶標物質上，由20-100 個核苷酸組成的單鏈脫氧核糖核酸（ssDNA）或核糖核酸（RNA）［2-3］，一般通過指數富集的配體系統進化技術（SELEX），從由隨機核苷酸組成的寡核苷酸文庫中篩選得到。

核酸適配體可以折疊形成一個特定且穩定的三維結構，以高親和力和特異性與靶標結合。平衡解離常數（KD）表示游離核酸適配體和游離靶標的結合程度，反映了核酸適配體與靶標分子的結合親和力。高KD值表示核酸適配體與靶標分子的結合能力弱，表明核酸適配體對靶標的親和力低；而低KD值則表示核酸適配體與靶標分子的強結合，表明核酸適配體對靶標的親和力高［4］。一般來說，核酸適配體的KD值在皮摩爾到微摩爾的范圍內［5］。抗體通常在納摩爾到微摩爾范圍內以非常高的親和力結合靶標分子［6］。與抗體相比，核酸適配體對靶蛋白的親和力相對接近甚至更高［7］，并且核酸適配體可以替代常用的ELISA 中的抗體［8］。另外，核酸適配體的特異性結合靶點豐富，包括金屬離子［9］、蛋白質［10］、病毒［11］、全細胞［12］等。與傳統蛋白抗體相比，核酸適配體具有體積小、分子量低、靶標范圍廣、穿透力強、特異性高、易于化學修飾、穩定性高、無批次間差異、保質期長、毒性低、免疫原性低等優點［13］。核酸適配體的出現為生物醫學領域提供了一個新穎、高效、快速的鑒定研究平臺，發展迅速具有良好的應用前景。

傳統藥物以化學小分子為主。近年來，以抗體和細胞藥物為代表的生物藥物被廣泛認可［14-15］。對核酸結構和功能的深入研究發現，它不僅可以作為疾病的生物標志物，而且可以作為疾病治療藥物。核酸藥物具有良好的臨床應用前景，如能夠對化學藥物或抗體藥物無法靶向的位點進行特異性靶向和調控。因此，它們可能會對傳統藥物療效不佳的疾病產生突破性影響［16］。功能性核酸治療劑是疾病治療的發展趨勢。目前，核酸藥物種類繁多，包括核酸適配體［17］、反義寡核苷酸［18］、siRNA［19］、核酶［20］、脫氧核酶［21］和CpG 寡核苷酸［22］等。其中，核酸適配體是功能性核酸研究中的重中之重，相較于其他核酸藥物，它不僅具有低藥物毒性、低免疫原性的特征，而且它的靶向位點更加豐富，可以直接作為藥物影響靶點的生理活性與下游通路，也可以作為靶向遞送工具遞送傳統藥物。細胞是人體最基本的組成單元，大量的疾病發病與進展都是由于細胞發生非正常生理變化而導致。因此越來越多的研究關注于細胞以開發疾病治療的策略，細胞特異性核酸適配體的研究應運而生，逐漸成為疾病治療策略開發的重要發展方向。

本文總結了細胞特異性核酸適配體作為一種功能性核酸在疾病治療中的研究進展，從細胞特異性核酸適配體的靶向位點、功能到其在各種疾病治療中的應用，包括作為靶向工具改善細胞狀態、募集細胞和治療藥物，以期為其在人類疾病治療中的應用提供參考（圖1）。

圖1 細胞特異性核酸適配體在疾病治療中的應用Fig. 1 Application of cell-specific nucleic acid aptamers in disease treatment

1 細胞特異性核酸適配體

1998 年，Morris 等［23］改進并完善了SELEX，篩選出紅細胞膜上所有組分的核酸適配體并進行了解析，這是細胞特異性核酸適配體的首次篩選，此后的幾十年，針對細胞的適配體被大量開發。細胞特異性核酸適配體的獨特之處在于它們的特異性靶標是細胞成分，并且越來越多的研究表明，它們可以通過靶向與細胞生長和代謝相關的物質，或者作為靶向遞送工具，直接或間接地影響細胞內生理活動或細胞外微環境。因此，細胞特異性核酸適配體引發了廣泛關注，并已用于細胞靶點的發現［24］、疾病診斷［25］、藥物遞送［26］和免疫療法［27］。

2 細胞特異性核酸適配體的臨床現狀

核酸適配體的理性篩選、裁剪和修飾促進了核酸適配體的開發研究，并發展出了多種應用。特別是細胞特異性核酸適配體在疾病治療中顯示出巨大的潛力和適用性。它們不僅可以作為識別特定靶標的簡單診斷成像和遞送工具，而且還可以作用于靶標分子來激活或抑制下游通路，或作為拮抗劑阻斷蛋白質或受體配體相互作用。

目前，許多有重要意義的細胞特異性核酸適配體仍在開發和測試階段，已有11 種核酸適配體被臨床轉化，并處于臨床研究的不同階段（表1）。這些核酸適配體的治療范圍包括眼部疾病、凝血、腫瘤和炎癥。其中就有針對眼部疾病的年齡相關性黃斑變性（AMD）。除此之外，這些核酸適配體針對的疾病還包括冠狀動脈疾病、急性心肌梗死、嗜血癥、白血病、2 型糖尿病、蛋白尿、慢性貧血等，通常通過注射給藥進行治療。還有一些核酸適配體尚未進入臨床試驗，但已顯示出巨大的臨床應用潛力，如多價核酸適配體和環狀核酸適配體。

表1 進入臨床試驗中的核酸適配體Table 1 Nucleic acid aptamers entering clinical trials

3 細胞特異性核酸適配體的篩選方法

為了篩選得到細胞特異性核酸適配體，研究人員以SELEX 技術為基礎開發了針對細胞的Cell?SELEX 技術（圖2）［28］，使得細胞特異性核酸適配體的開發得到迅速發展。Cell?SELEX 是以完整的細胞為靶標，篩選特異性核酸適配體的方法，所選的正篩細胞靶標通常是與某些疾病相關的病變細胞，再選擇相對應的正常細胞作為反篩細胞，還需要合成一個隨機的核酸序列文庫，通常是由兩端含有引物序列，中間含有20-100 個隨機核苷酸組成。

圖2 細胞特異性核酸適配體的篩選方法Fig. 2 Screening methods for cell-specific nucleic acid aptamers

在適宜的條件下分別培養正篩和反篩細胞至合適密度，將隨機的核酸序列文庫先后與兩種細胞孵育，通過細胞收集、高溫解離、離心沉淀等操作收集可以結合病變細胞但不結合正常細胞的隨機核酸序列，再重復多輪上述操作，這樣篩選得到的核酸適配體就能精準靶向具有某些生物標志物的疾病相關細胞。傳統的Cell?SELEX 篩選的整個過程中無需知道細胞表面的蛋白種類和數量，同時無需純化靶標蛋白，降低了篩選成本。另外，在Cell?SELEX 過程中細胞表面的膜蛋白保持著天然構象，與利用純化蛋白篩選相比得到的核酸適配體能夠更準確地識別靶細胞。

近年來，隨著細胞特異性核酸適配體的需求豐富化、多樣化，為了提高細胞特異性適配體篩選的效率和富集度，基于Cell?SELEX 技術演變出更多的細胞特異性適配體篩選方法，包括等基因細胞SELEX（Icell?SELEX）、熒光激活細胞分選FACS?SELEX、配體引導選擇（LIGS）、3D?SELEX、細胞內化SELEX 等。不同的SELEX 方法使用不同的技術和工具來選擇核酸適配體，但從概念上講，所有這些方法都基于相同的基本原理，即反復選擇和擴增，以獲得具有高特異性、高親和力的核酸適配體。

4 細胞特異性核酸適配體在疾病治療中的應用

經過篩選得到的細胞特異性核酸適配體能夠與特定的細胞標志物靶向結合，利用其獨特的化學結構，可以精準遞送各類藥物、聚集不同細胞、封閉或激活相關受體通路、干擾蛋白活性等。這就有利于將其應用到多種疾病的臨床治療中，本文以疾病類型為劃分方式，總結細胞特異性核酸適配體在不同疾病治療中的應用，表2 歸納了針對不同疾病已經開發或正在研究中的核酸適配體藥物。

表2 不同疾病治療中開發的核酸適配體的應用Table 2 Applications of nucleic acid aptamers developed in the treatment of different diseases

4.1 在癌癥治療中的應用

化療是癌癥治療中最常用的手段，但是傳統的化療藥物靶向性差、副作用強，基于細胞特異性核酸適配體的遞送能夠實現精準靶向，并且可以克服一些化療藥物脂溶性差、劑量高和效果不理想等問題，還可以實現藥物協同作用［29］。

核酸適配體-藥物偶聯物（ApDCs）領域正在迅速發展。核酸適配體與藥物偶聯的最簡單形式是非共價連接。最典型的遞送藥物是多柔比星（Dox），它是一種具有芳香環的細胞毒性藥物，能夠嵌入到DNA 的?GC?富集區域，從而阻斷DNA 復制并導致細胞死亡。多種核酸適配體?Dox 復合物是通過將Dox 結合到核酸適配體結構中形成的。這類方法已被用于治療多種癌癥細胞系，如研究人員篩選出一種靶向急性髓系白血?。ˋML）細胞系表面未成熟層黏連蛋白受體蛋白（OFA/iLRP）的核酸適配體（AB3），將阿霉素插入AB3 的DNA 結構中形成了核酸適配體-多柔比星（Apt?Dox）復合物，Apt?Dox能有效破壞OFA/iLRP 陽性AML 細胞［30］。

盡管非共價連接簡單有效，但存在藥物無法嵌入到核酸適配體中的情況，因此需要通過共價連接載藥［31］。基于核酸適配體的化學性質，研究提出了多種不同的核酸適配體-藥物共軛方法，例如共價交聯、生物相容性墊片、可裂解接頭和疏水相互作用。靶向蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）的核酸適配體sgc8c 和Dox，通過腙鍵共價連接形成絡合物，腙鍵對pH 敏感，在腫瘤部位的酸性環境中容易斷裂而起到靶向釋放藥物的效果［32］。研究人員構建了一種核酸適配體-多肽，通過親核酰基取代共價共軛Dox 和喜樹堿（CPT），然后通過點擊化學連接到核酸適配體AS1411 上。該結構在體外對MDA?MB?231人乳腺癌細胞顯示出極低的IC50，在體內微劑量注射的情況下顯示出療效［33］。

利用核酸適配體靶向遞送化療藥物最大程度地降低了藥物的副作用，但仍然會對肝、腎等器官帶來負擔，相對安全可靠的核酸療法在癌癥治療中顯示出更大的應用潛力。研究人員開發了核酸適配體介導的核酸遞送，該遞送系統的構建使得基于基因的核酸治療更加高效和穩定。研究人員研發了多價核酸適配體?siRNA 綴合物以克服多藥耐藥性［34］，如黏蛋白?1 核酸適配體連接Bcl2 特異性siRNA 與阿霉素［35］，研究人員還合成了基于核酸適配體的脂質體，AS1411 核酸適配體偶聯脂質體靶向結直腸癌（CRC）細胞遞送siRNA 干擾COL1A1基因表達［36］，提高了腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。

有許多細胞特異性核酸適配體在靶向細胞遞送藥物時還具有細胞內化作用，更有利于藥物進入細胞內發揮作用，涵蓋多種細胞類型，包括癌細胞、癌癥干細胞［37］和平滑肌細胞［38］，這些核酸適配體介導的藥物和siRNA 的遞送對于癌癥等疾病的治療具有重要意義。例如核酸適配體sgc8c 無需外部幫助即可內化到T 細胞淋巴母細胞白血病細胞中［39］，此外還有許多內化細胞表面標志物的核酸適配體，例如癌胚抗原（CEA）［40-41］、前列腺特異性膜抗原（PSMA）［42］和白細胞介素6 受體（IL6R）［43］。

除了利用核酸適配體遞送藥物來抑制腫瘤細胞生長外，雙特異性核酸適配體可以直接介導腫瘤細胞裂解或免疫反應，基于這一概念，研究人員開發了一種穩定的基于核苷酸的雙特異性核酸適配體，可介導c?Met 陽性腫瘤的裂解［44］，為腫瘤治療開辟了新途徑。還構建了一種針對MUC1 陽性腫瘤細胞和CD16 陽性淋巴細胞的多價雙特異性核酸適配體，它能夠聚集兩種類型的細胞，并增強抗腫瘤反應［45］。雙特異性核酸適配體將免疫細胞吸引至腫瘤的機制細胞大大增加了兩種細胞之間相互作用的機會，從而激活淋巴細胞并增強抗腫瘤反應。

此外，核酸適配體工程自然殺傷細胞（ApEn?NK）已廣泛用于基于核酸適配體的免疫療法。研究人員構建了核酸適配體-親脂性分子錨定結構與NK92 細胞培養［30］，并探討了其穩定性。該研究證明ApEn?NK 具有特異性攻擊淋巴瘤細胞的免疫治療潛力。還有報道在NK 細胞表面原位合成基于核酸適配體的多價抗體模擬物（PAM），大大增強了免疫細胞和癌細胞之間的相互作用［46］。此外，研究人員已經提出了培養特異性、通用性和滲透性NK 細胞的策略。這種NK 細胞配備有靶向核酸適配體和檢查點阻斷核酸適配體，能高度浸潤到腫瘤深部區域，并為實體瘤的增強過繼免疫療法提供很大潛力［47］。

4.2 在組織修復與再生中的應用

典型的細胞募集和再生治療方法是使用細胞特異性核酸適配體來鑒定和捕獲用于組織工程的間充質干細胞（MSCs）。這些研究大多集中在骨和軟骨組織修復方面，在骨治療中將骨髓間充質干細胞（BM?MSCs）的核酸適配體負載到支架上，募集BM?MSCs 實現再生治療［48］。

由于外源性干細胞移植常引起軟骨組織工程中的問題，如低存活率和外源性感染的風險，因此基于核酸適配體的自體BM?MSCs 的募集是非常重要的。這種核酸適配體功能化的支架可以募集BM?MSCs 并支持細胞黏附，同時還可以刺激BM?MSCs的定向分化。已經開發了多種細胞特異性核酸適配體介導的組織修復支架，包括針對不同組織特性和軟骨下骨的再生能力設計的雙功能雙層支架［49］，以及簡單制備的生物納米顆粒。

研究人員通過在含有刺激因子KGN 的基于海藻酸鈉（SA）的網絡中交聯氧化石墨烯（GO）以形成GO?SA 凝膠［50］，該凝膠與生物礦物骨架（GBF）組裝形成核酸適配體修飾的雙層支架。這種雙層支架有效募集MSCs，在支架內，KGN 促進MSCs 向軟骨細胞分化，而核酸適配體?GBF 加速了MSCs 向成骨細胞的成骨分化，從而成功實現了膝關節軟骨和成骨的同時再生。

除了干細胞之外，也可以招募其他幾類細胞。對支架表面生物功能化的研究顯示，核酸適配體對成骨誘導的頜骨骨膜細胞（JPCs）有結合親和力，從而增強骨組織工程中的細胞黏附和礦化［51］。研究人員在皮膚損傷小鼠模型中通過趨化因子FKN 核酸適配體功能化水凝膠募集非經典單核細胞M2 樣巨噬細胞，從而增強組織修復［52］。

4.3 在眼部疾病中的應用

由Eyetech 和輝瑞公司共同開發和制造的Macugen，是核酸適配體成功治療疾病的應用之一。這是2004 年11 月美國食品藥物管理局批準的第一個靶向VEGF 用于治療眼部疾病年齡相關性黃斑變性（AMD）的核酸適配體［53］。每6 周向眼部玻璃體內注射Macugen，能夠特異性結合VEGF165，阻止眼部VEGF 受體被激活，從而抑制脈絡膜新生血管的生成［54］。目前有3 種核酸適配體可用于治療眼部疾病。除了VEGF，PDGF 和補體成分5（C5）也是治療靶點，因為單獨的抗VEGF 治療可能無法防止由于周細胞相關的血管成熟導致的新血管退化。PDGF在周細胞募集中發揮作用，也是AMD 的潛在治療靶點［55］。核酸適配體E10030 是一種靶向PDGF 的聚乙二醇偶聯的核酸適配體，已經在多個III 期臨床項目中評估了安全性和有效性［56］。而C5 與AMD 炎癥誘導損傷的發病機制有關［57］，靶向C5 核酸適配體ARC1905 也在AMD 治療的臨床研究中［58］。

4.4 在腦部疾病中的應用

腦部疾病的治療受到血腦屏障的極大阻礙，血腦屏障限制了絕大多數小分子進入大腦?？朔@一屏障的新方法是靶向內皮細胞膜上的受體，借助受體介導的轉運機制通過血腦屏障。研究人員將與上皮細胞黏附分子結合的核酸適配體與靶向轉鐵蛋白受體（TfR）的核酸適配體融合，產生雙功能核酸適配體，已開發SYL3C?GS24 雙功能核酸適配體來克服血腦屏障，可用于治療特定的腦部疾?。?9］。

Tau 是一種關鍵的神經元微管穩定蛋白，有助于微管組裝和軸突生長。研究表明，不受調節的過度磷酸化和其他翻譯后修飾的積累會使Tau 從多功能蛋白轉化為神經毒物，觸發Tau 聚集并最終導致不可逆的神經病變。有研究報道了一種環狀雙功能核酸適配體的合成，以增強體內血腦屏障滲透，從而更好地進行Tau 蛋白病治療［60］。這種環狀核酸適配體由一種轉鐵蛋白受體核酸適配體和Tau 蛋白核酸適配體組成，TfR 核酸適配體識別內皮細胞誘導轉運，Tau 核酸適配體可以抑制大腦中的Tau 磷酸化和其他與Tau 蛋白病相關的病理變化。這種新型環狀Tau?TfR 雙功能核酸適配體顯著克服血腦屏障，改善Tau 蛋白病和體內創傷性腦損傷（TBI）誘導的認知缺陷，證明環狀Tau?TfR 核酸適配體可以進一步開發為Tau 蛋白病的診斷和治療候選物。

4.5 在血管疾病中的應用

血栓仍然是全球死亡和殘疾的主要原因。血栓的形成與凝血功能紊亂相關，凝血是血管壁受損時血液形成凝塊的復雜過程，這一過程通過級聯反應產生纖維蛋白達到止血目的，受多種凝血因子的調節?？鼓怂徇m配體以高親和力和特異性與凝血因子結合，阻礙蛋白質-蛋白質識別反應，具有獨特的治療調節能力。

目前有4 種核酸適配體正在進行與凝血相關的臨床試驗，分別是REG1、ARC1779、BAX499 和NU172。REG1 是一種新型抗凝系統，由凝血因子IXa 的RNA 核酸適配體抑制劑和互補序列逆轉寡核苷酸組成［61］。ARC1779 識別血管性血友病因子（VWF）A1 結構域，可以阻斷VWF 的A1 結構域與血小板GPIb 受體的相互作用，從而在冠狀動脈狹窄條件下調節血小板黏附、活化和聚集［62］。組織因子通路抑制劑（TFPI）是組織因子引發凝血的主要抑制劑，使其成為血友病治療中新穎的治療靶點，核酸適配體BAX499 通過特異性抑制TFPI 來改善止血，并可調節血友病患者血漿中的凝血酶生成［63］。NU172 是一種G?四鏈體DNA 核酸適配體，可靶向凝血酶，有短效抗凝作用［64］?？鼓怂徇m配體的開發和應用將對血栓患者的治療治愈產生積極作用。

4.6 在炎癥疾病中的應用

細胞因子核酸適配體的研究也具有重要意義，例如TNFα 是促炎細胞因子，是與炎癥性疾病相關的細胞因子網絡的關鍵組成部分。已證明與人TNFα特異性結合的核酸適配體VR11［65］可抑制TNFα 信號通路，并已開發用于TNFα 檢測。研究人員設計了一種使用VR11 功能化單層石墨烯作為導電通道的超柔性和可拉伸納米傳感器［66］，其中VR11 與TNFα 的特異性結合會引起石墨烯載體濃度的變化，從而能夠測量TNFα 濃度。這種納米傳感器可以作為檢測人體皮膚或組織表面發生明顯變形時的液體生物標志物的潛在可靠工具。

NOX?E36 和NOX?H94 這兩種抗炎核酸適配體是NOXXON 公司開發的。NOX?E36 識別趨化因子配體2（CCL 2）并通過與CCL 2 結合以減少白細胞募集來預防炎癥［67］，而NOX?H94 則靶向調節鐵穩態的肽激素鐵調素，并干擾鐵調素和鐵轉運蛋白［68］，有助于改善炎癥帶來的慢性疾病難以治愈的問題，可分別用于診斷和治療2 型糖尿病或慢性貧血。

5 總結與展望

細胞特異性核酸適配體作為一種強大的親和工具，在疾病診斷、分子成像、生物標志物發現、藥物遞送和基因治療等領域有著廣泛的貢獻。根據研究的需求，可以通過Cell?SELEX 技術，從龐大的隨機核酸文庫中篩選出能特異性靶向細胞的核酸適配體，并且有越來越多的新型Cell?SELEX 技術讓篩選變得更加高效和準確，也使得細胞特異性核酸適配體的研究進程突飛猛進。

細胞特異性核酸適配體有著豐富的功能。首先，它可以作為一種靶向工具與靶標分子高度特異性結合實現疾病診斷或藥物遞送，這對于疾病的精準治療有著突破性貢獻，大大提高了疾病的治療效率；其次，它可以直接作為治療劑與靶標結合，從而激活或抑制細胞活動的相關通路來發揮作用，與傳統化學藥物相比，更加安全可靠；此外，核酸適配體還可以作為細胞外基質和細胞生長因子的模擬物，以及細胞招募的介質，在組織修復和再生醫學中發揮重要作用。由于這些獨特的優勢，細胞特異性核酸適配體在人類疾病治療方面具有重要地位，在包括癌癥、眼部疾病、血管病、神經病變、炎癥疾病和組織損傷等領域得到廣泛關注和應用，越來越多的國內外醫藥企業也在投入大量的成本用于細胞特異性核酸適配體藥物的開發，細胞特異性核酸適配體的治療潛力還有望在更多領域得到進一步研究和應用。

盡管有許多基于細胞特異性核酸適配體開發的治療藥物有著巨大的臨床應用潛力，但是細胞特異性核酸適配體還存在一些需要解決的問題，例如提高穩定性、安全性評價、降低篩選難度、開發口服遞送載體等，所以目前只有較少藥物進入臨床試驗階段，更少有進入臨床應用。由此可見，雖然細胞特異性核酸適配體在治療人類疾病方面展現了極大的希望，但也充滿著巨大的挑戰。相信在未來，隨著科研人員的不斷探索，目前所面臨的問題將被一一攻克，細胞特異性核酸適配體的潛力將被極大程度地開發，為人類疾病的治療作出越來越多的貢獻。