熒光素酶輔助定量大腸桿菌破碎效果的方法

李奕雅 吳一凡 丁能水 范小萍 陳凡

（1. 閩南師范大學生物科學與技術學院，漳州 363000；2. 福建傲農生物科技集團股份有限公司，漳州 363000）

20 世紀末以來，隨著DNA 重組技術的蓬勃發展以及蛋白質分離純化技術的不斷進步，基于原核生物蛋白質表達系統的異源蛋白高效生產早已成為現實［1-3］。在原核表達體系中，以大腸桿菌為代表的表達系統具有遺傳背景清晰、生長快速、表達量高、易于操作、連續發酵能力強等優點，已廣泛作為外源蛋白的表達宿主［4］。

然而，在基于大腸桿菌的外源蛋白表達體系中，作為分離純化目標的靶蛋白往往以胞內組分的形式存在。在分離提取環節，為了使細胞內含物得到釋放，首先必須對細胞進行破碎或裂解。因此，細胞的破碎便成為提取胞內生物活性物質的關鍵技術［5］。目前，常用的大腸桿菌細胞破碎技術，主要有高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎法、酶溶法、化學滲透法等［6］。其中，超聲破碎法作為一種低成本、易使用的菌體破碎手段，一直被廣泛應用。該法利用超聲波在液體介質中引起的空化效應，產生高壓力的沖擊波和局部高溫，破壞細胞壁的網狀結構，使細胞內容物釋放出來，參與后續的純化過程［7］。其作用效果受到探頭直徑、超聲功率、溶液體積、容器大小、容器材質、破碎緩沖液組成以及超聲作用時間等多方面因素的協同影響，若不作針對性優化，則難以達到較好的效果——在保證破碎率的基礎上，盡可能保全靶蛋白的生物活性［8］。因此，超聲破碎的參數優化，就成為原核表達蛋白質純化過程中的關鍵步驟之一。而這一優化過程，往往需要借助SDS?PAGE 及其后續的染色結果判斷，費時費力且只能得到半定量的結果，效率與精度亟待提高［9］。

螢火蟲（Photinus pyralis） 熒光素酶（firefly luciferase, FLuc）大量存在于螢火蟲尾部，與生物發光密切相關［10-12］。其分子量約61 kD，常用于報告基因檢測，具有靈敏度高、半衰期短、特異性強等特點，早已成為醫學和生命科學研究領域的重要標記工具［13-15］。目前，已有研究表明［16］，FLuc 的作用底物D?Luciferin 在堿性條件下帶負電荷，無法穿透大腸桿菌的細胞壁與細胞膜，不能與胞內的FLuc產生反應。若控制緩沖液的pH 值在堿性范圍，則向表達FLuc 的菌懸液中添加底物時，底物僅與游離的FLuc 產生反應，發出熒光，故可用于表征菌體裂解時外屏障的受損情況。此外，FLuc 自身熱穩定性不佳［17］，在35℃以上環境中，即可檢測到活性顯著下降。這一特點可用于破碎過程中超聲熱效應的判定，為維持靶蛋白特別是熱不穩定靶蛋白在破碎環節中的活性提供重要參考。

本研究使用基于大腸桿菌cspA啟動子的原核表達載體［18］，利用螢火蟲熒光素酶活性作為破碎指標，考察了其在海腎熒光素酶（Renilla luciferase, RLuc）、增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）和紅色熒光蛋白（mCherry）表達菌株破碎過程中的定量效果。研究成果為大腸桿菌細胞破碎過程中的條件優化和目標蛋白的活性保全提供了簡便易行的評價手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 pCold III DNA 載體（寶日醫生物技術（北京）有限公司）；BL21 化學感受態細胞（上海唯地生物技術有限公司）。轉化了pCold?FLuc、pCold?RLuc、pCold?EGFP 和pCold?mCherry 等表達載體的BL21 菌種由本課題組構建并保存，各載體結構如圖1 所示。

圖1 本研究使用的載體結構示意圖Fig. 1 Schematic representation of the plasmid structures used in this study

1.1.2 試劑 酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid）；氯化鈉、甘油（國藥集團化學試劑有限公司）；氨芐青霉素鈉鹽、RealBand 三色預染蛋白Marker、IPTG（生工生物工程（上海）股份有限公司）；10×SDS 電泳緩沖液、10%蛋白預制膠、Ni?NTA 樹脂（鎳珠）（北京蘭博利德商貿有限公司）；DL101?01 雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.1.3 儀器 XS?TD1 臺式全溫振蕩培養箱（象尚昱科（上海）實驗儀器有限公司）；Spark 多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；T30D 型三槽超級梯度PCR 儀（杭州朗基科學儀器有限公司）；UV?1600 紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；H2050R?1 高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）；VCX800 細胞破碎儀（美國Sonics 公司）；Imager 600 UV 生物分子成像儀（美國GE 公司）；DYCZ?24DN 垂直電泳槽、DYY?6D 電腦三恒多用電泳儀電源（北京六一生物科技有限公司）；VM?100旋轉混合儀（杭州佑寧儀器有限公司）；GelSMART凝膠成像儀（大龍興創實驗儀器（北京）股份公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化與靶蛋白的誘導表達 取保存于?80℃的甘油菌1 μL，加入到750 μL 氨芐（100mg/L，下同）抗性LB 培養基中，置于37℃，220 r/min環境中振蕩培養16 h。隨后取其中的500 μL，加入到150 mL氨芐抗性LB培養基中，繼續37℃，220 r/min振蕩培養至濁度（以OD650計，避免mCherry 被入射光激發，干擾檢測［19］）介于0.5-0.6 之間，再添加終濃度100 μmol/L 的IPTG，置于15℃，220 r/min環境下繼續培養24 h，并開展后續實驗。

1.2.2 菌體的超聲破碎 按1.2.1 所述步驟誘導表達后的菌液，在7 000 ×g，4℃離心2 min 后，棄上清，收集菌泥，以20 mL 冰冷的PBS 緩沖液（pH 7.4，0.01 mol/L，下同）重懸，重復離心一次，棄上清后以10 mL 冰冷的PBS 重懸。隨后利用50 mL 離心管盛放菌液，置于冰水混合物中，使用直徑6 mm 的超聲探頭，在指定功率下按照“破碎2 s，停止3 s”的條件破碎并采樣檢測。破碎樣品經15 000 ×g，4℃離心15 min 后，取上清液檢測蛋白質活性。

1.2.3 熒光素酶活性檢測 取一定量經PBS 稀釋的熒光素酶樣品，用試劑盒附帶的細胞裂解液補足20μL 后，利用多功能酶標儀逐孔檢測。檢測時，利用自動進樣器添加對應的底物，再對酶標板進行2 s 的振蕩，隨后立即檢測熒光強度。此外，檢測FLuc 活性時，設置數據衰減模式為“OD1”（約衰減到原始數值的10%）；檢測RLuc 活性時，應將儀器衰減模式設置為“OD3”（約衰減到原始數值的0.1%），以避免過曝。

1.2.4 熒光蛋白活性檢測 利用多功能酶標儀檢測EGFP（濾光片組合：EX?485；EM?535）和mCherry（濾光片組合：EX?535；EM?595）活性時，取破碎后的上清液，用PBS 補足100 μL 后上機檢測。為避免過曝，EGFP 檢測過程中需將增益值（Gain）設置為45，mCherry 檢測時需將增益值設置為60。

1.2.5 螢火蟲熒光素酶輔助破碎定量效果檢測 按1.2.1、1.2.2 有關步驟進行靶蛋白誘導表達和菌體清洗，最終得到表達4 種靶蛋白的菌懸液各10 mL。此后，向含有RLuc、EGFP 和mCherry 的菌懸液中，各加入20 μL 表達了FLuc 的菌懸液。再于160 W 功率下進行超聲破碎。破碎結束后，取上清液2.5 μL，按1.2.3 所述方法直接檢測螢火蟲熒光素酶活性；針對海腎熒光素酶，則取稀釋500 倍后的上清液2.5μL 檢測；對于含有EGFP 或mCherry 的上清液，則按1.2.4 所述步驟，取5 μL 上清液檢測活性。

1.2.6 溫度對蛋白質活性的影響評價 按1.2.1、1.2.2 所述步驟進行靶蛋白誘導表達和菌體破碎（160W，15 min）。隨后取若干個0.2 mL 離心管，每管加入50 μL 含有靶蛋白的上清液，先利用梯度PCR 或冰水混合物（0℃）孵育15 min，再以室溫孵育15 min，隨后以0℃處理的樣品活性為100%，檢測并計算各靶蛋白的殘余活性。

1.2.7 不同破碎功率對熒光素酶活性的影響評價 按1.2.1、1.2.2 有關步驟進行靶蛋白誘導表達和菌體清洗，得到表達FLuc 和RLuc 的菌懸液各10 mL，取每種菌懸液20 μL，加入到10 mL 冰冷的PBS 中，混合均勻后按1.2.2 所述的超聲破碎方法分別使用160 W、240 W 和320 W 超聲功率進行菌體破碎，并于破碎過程中定時采樣獲得破碎上清液，取其中2.5 μL 直接檢測熒光素酶活性。

1.2.8 蛋白質活性的半定量攝像 針對FLuc 樣品，取少量含有FLuc 的破碎上清液，用試劑盒附帶的細胞裂解液補足20 μL，再加入檢測用底物溶液100μL，混合2 s 后立即使用攝像頭采集反應圖像。針對EGFP 或mCherry 樣品，取少量含熒光蛋白的破碎上清液，用PBS 補足100 μL 后，通過485 nm 光源激發熒光，以520 nm 濾光板（長通型）輔助拍照。

1.2.9 蛋白質的鎳珠法純化與電泳檢測 用10 倍鎳珠體積的PBS 清洗鎳珠3 次，再將等體積的鎳珠添加到待純化的蛋白質溶液中，混勻后取樣保存。隨后以20 r/min，4℃上下回旋振蕩12 h，500 ×g離心3 min 后取少量上清液保存。再以PBS 清洗鎳珠3 次，取約20 μL 鎳珠顆粒保存。最后將終濃度1×的SDS?PAGE 上樣緩沖液加入各樣品中，定容至100 μL，95℃加熱10 min 后取其中15 μL 進行SDS?PAGE（分離膠濃度10%）檢測，并以考染方式分析電泳結果。

1.2.10 凍存菌的破碎與檢測 按1.2.1 所述步驟誘導表達靶蛋白的菌液，離心清洗菌體1 次，用10mL 含有體積分數為30%的甘油的PBS 重懸。再將重懸后的菌液分裝置于?80℃冷凍保存。此后，每隔30 d 取出含有FLuc 和RLuc 的菌懸液各1 mL，37℃水浴解凍，離心后用10 mL 冰冷的PBS 重懸，隨后以160 W 功率破碎，并定時取樣。破碎上清液用PBS 稀釋50 倍后，取2.5 μL 檢測熒光素酶活性。

1.2.11 統計分析 所有檢測結果使用Minitab v17.0軟件進行數值統計，數據以“平均值±標準差（mean± SD）”形式表示（每組實驗均重復3 次）。待比較數據的方差一致時，使用Tukey 方法進行多重比較；方差不一致時，使用Games?Howell 方法進行多重比較。同一實驗中，不含共享字符的兩組數據存在顯著差異（P<0.05）。

2 結果

2.1 熒光素酶和熒光蛋白活性檢測條件的確定

在各靶蛋白的誘導表達和菌體超聲破碎（160 W，20 min） 后， 對含有FLuc、RLuc、EGFP 和mCherry 等4 種蛋白質的上清液進行活性檢測（FLuc和RLuc 樣品在檢測前須稀釋500 倍），并繪制標準曲線（圖2）。由各標準曲線可見，本研究選擇的樣品添加量與反應熒光強度存在較強的線性關系，可認為對應的檢測方法和上清液用量是有效且準確的。此外，基于圖2 所示數據可知，在輔助破碎的過程中，向目標菌懸液中按1∶500（體積比）添加表達FLuc的菌懸液，能夠將檢測讀數控制在標準曲線所及的范圍內并留有余量，足以為破碎過程提供定量依據。

圖2 經誘導表達的4 種蛋白質活性標準曲線Fig. 2 Standard curves of four induced proteins activities after induction

2.2 超聲破碎的螢火蟲熒光素酶輔助定量效果檢驗

確定輔助定量所需的FLuc 菌液用量后，按照1.2.5 所述步驟，檢驗FLuc 表達菌對RLuc、EGFP和mCherry 表達菌的超聲破碎輔助定量效果。以破碎樣品中活性最強的平均值為100%，繪制活性變化曲線如圖3 所示。通過對圖3 中各子圖的分析可知，FLuc 在破碎上清液中的活性上升趨勢與3 種靶蛋白基本一致。說明FLuc 對靶蛋白的釋放過程起到了良好的定量表征作用，能為不同條件下超聲破碎參數的設置提供有效參考。

圖3 三種菌懸液超聲破碎的螢火蟲熒光素酶輔助定量結果圖Fig. 3 Firefly luciferase-assisted quantification of ultrasonic disruption for three bacterial suspensions

2.3 螢火蟲熒光素酶對超聲破碎功率的敏感性測試

按1.2.6 所述實驗步驟，對4 種蛋白質分別進行加熱和保溫處理，探討溫度對4 種蛋白質活性的影響，結果如圖4 所示，可得到如下結論：（1）由圖4?A,B 可見，FLuc 和RLuc 在38.5℃和40℃環境下處理15 min 后，活性明顯下降，且FLuc 活性損失較大。（2）在圖4?C, D 中，EGFP 和mCherry 所表現出的熱穩定性遠高于熒光素酶，其活性僅在處理溫度大于67℃后出現下降，且mCherry 的活性下降更為緩慢。因此，后續宜選用“FLuc+RLuc”這一對溫度更敏感的蛋白質組合，考察不同破碎功率對終產物活性的影響。

圖4 不同處理溫度下4 種蛋白質活性的變化Fig. 4 Activity changes of four proteins incubated under different temperatures

按1.2.7 所述步驟，以不同超聲功率對熒光素酶表達菌進行破碎，結果顯示，（1）以160 W 功率破碎（圖5?A），熒光素酶活性在10 min 內達到最大值，隨后逐步下降，破碎25 min 后，兩種酶的活性損失均大于45%。（2）以240 W 功率破碎（圖5?B），熒光素酶活性在5 min 內達到最大并迅速下降，破碎結束后，兩種酶的活性損失均大于85%。（3）以320 W 功率破碎（圖5?C），熒光素酶活性在10 min內就經由升高到近乎完全損失，高功率帶來的負面效應明顯。綜合圖5 所示結果，認為FLuc 的活性變化確實能夠反映出破碎條件過于劇烈的可能，從而為蛋白質活性的保全提供重要參考。

圖5 不同超聲破碎功率對破碎后熒光素酶活性的影響Fig. 5 Effects of different ultrasonic power on luciferase activity after sonication

2.4 添加熒光素酶對靶蛋白純化的影響

本研究使用的FLuc 不帶純化標簽且用量極少，理論上不干擾靶蛋白的后續純化。為驗證該假設，首先按照1.2.8 所述步驟，拍攝了實驗2.1 所使用的FLuc、EGFP 和mCherry 破碎上清液的活性影像，結果如圖6?A-C 所示。可見各上清液中確實含有與樣品對應的外源蛋白。隨后再將FLuc/EGFP 或FLuc/mCherry 上清液按2∶1（體積比）混合，作為待純化的樣品，按1.2.9 所述步驟進行鎳珠吸附檢測，結果如圖6?D 所示。由該結果看出，即便在過量添加FLuc 的樣品中，該酶也難以被鎳珠吸附，其對應條帶基本保留在上清液中，與EGFP 和mCherry 的顯色結果截然相反。因此，以FLuc 作為破碎輔助定量手段時，其對鎳珠純化過程及產物純度的影響可忽略不計。

圖6 螢火蟲熒光素酶的添加對靶蛋白后續純化的影響Fig. 6 Effect of firefly luciferase addition on the purification of target proteins

2.5 低溫凍存對輔助定量效果的影響

按1.2.10 所述步驟，驗證菌體凍存對輔助定量效果的影響，結果（圖7）顯示，兩種熒光素酶的活性曲線中，后3 組數據的均值在連續4 次檢測中未見下降趨勢（酶活僅因檢測溫度不同，略有波動），說明凍存期間兩種熒光素酶的活性并未產生可檢出的損失。熒光素酶活性曲線中，0-3 min 內的斜率最大，說明破碎初始階段，菌體對超聲作用最為敏感。而在連續4 次檢測中，位于3 min 數據點的數值，與后3 組數據均值之比都在50%-60%之間波動，同樣未見明顯上升趨勢。且圖7?A 所示新鮮菌液的破碎曲線與圖7?B-D 所示凍融菌的破碎曲線，在趨勢上也大體相同，可見一次凍融對大腸桿菌細胞壁或細胞膜的破壞有限，并不能大幅降低菌體對外力破壞的耐受性，凍融菌破碎難度與新鮮菌體基本一致。

圖7 不同凍存時間對螢火蟲熒光素酶輔助定量效果的影響Fig. 7 Effect of different cryo-storage time on firefly luciferase-assisted quantification

3 討論

螢火蟲熒光素酶具有靈敏度高、線性范圍廣、檢測操作簡單且結果容易量化等特點，在生物學和醫學領域具有廣泛的應用。本研究提出并驗證了大腸桿菌超聲破碎的螢火蟲熒光素酶輔助定量方法，進一步拓寬了熒光素酶的應用范圍，其主要優勢在于：（1）實際操作中，由于破碎效果受多種條件的協同影響，使超聲處理條件的精細優化較為繁瑣。本法利用表達了FLuc 的大腸桿菌作為內標，通過破碎過程中熒光素酶的活性釋放情況，表征待測菌體的破碎程度，特別適合靶蛋白活性檢測困難的場合，能為大腸桿菌的超聲破碎條件優化提供量化指導且不影響靶蛋白的后續純化，具有良好的可行性。（2）在超聲破碎過程中，氧化效應、空化效應，特別是熱效應的持續累積［20］，可能對靶蛋白的高級結構產生破壞，對終產物的質量產生不利影響。因此，一種能夠反映破碎條件是否過于劇烈，從而避免靶蛋白活性損失的指標就顯得極為重要。而熱穩定性不佳且分子量適中［21-22］的FLuc，恰恰適合監測破碎條件的劇烈程度，并能夠給出溶液的整體量化均數，對于穩定性高于FLuc 的靶蛋白，其數據有較高的參考價值，信息量豐富。但仍應注意在實際操作中，破碎條件對靶蛋白活性的影響，還與其自身的結構穩定性有關。對于具體的研究項目，靶蛋白與FLuc相比是否更為穩定，應通過預實驗對比確認。若遇到靶蛋白穩定性較差的情況，可考慮使用條件上更為溫和的化學或酶法裂解，減小破碎過程中的損失。（3）輔助定量過程中，FLuc 表達菌的用量極少。若FLuc 表達菌需要隨目標菌一同培養，則整個定量流程將過于繁瑣。而依據實驗結果，研究人員可將表達FLuc 的菌體分裝后低溫凍存，且凍存菌可在至少3 個月內保持相似的檢測靈敏度，對需要反復優化破碎條件的研究工作極為有利，也極大地保障了方法的實用性和便捷性。

此外，從本文所示的各項實驗結果中也能推斷：（1）輔助定量可使用的熒光素酶不僅限于FLuc。在本文所示數據中，RLuc 在破碎過程中的活性變化和FLuc 十分接近，同樣可以作為定量依據。但FLuc 在生物學研究中應用較早，試劑盒國產化程度高［23-25］，檢測成本相對低廉，故成為本研究的首選酶系。（2）因FLuc 的原核表達效率較高，故應避免使用閃光型熒光素酶檢測試劑盒。一方面其熒光強度高，容易造成檢測器過曝；另一方面，閃光型反應發光時間過短，檢測特別是手動加樣檢測時誤差較大，往往導致更大的數據變異系數，對輔助定量極為不利。（3）研究結果顯示，超聲破碎時，菌體的用量也能顯著影響破碎結果。相同功率下，菌體量少則破碎速度快，但破碎造成的蛋白質變性情況也將增加。這可能與菌體用量大時，隨菌體破碎而進入外部緩沖液的物質量增加有關。通常情況下，蛋白質自身或環境中極性氨基酸濃度增大時，其穩定性也相應提高。且游離到胞外的分子伴侶蛋白，也可能對靶蛋白的高級結構起到保護或修復的作用，故其整體活性能夠維持在比較高的水平［26-27］。（4）本研究中pCold III DNA 載體使用了大腸桿菌的cspA啟動子，故大部分大腸桿菌均可作為宿主使用，僅表達量可能有所不同，具備廣泛應用的潛力。且從理論上分析，無論使用何種破碎方式或表達宿主種類，只要該宿主表達的FLuc 有活性并累積于胞內，而破碎方式又不影響FLuc 的活性和檢測，均可使用本定量方法。（5）若靶蛋白的表達對細菌細胞壁或細胞膜有破壞作用，則兩種菌體破碎難度不同，不適用本研究所述的輔助定量方式。

4 結論

本研究建立了以螢火蟲熒光素酶為內標的大腸桿菌超聲破碎輔助定量方式，利用相對簡便的操作和穩定的檢測結果，較好地解決了大腸桿菌超聲破碎過程中的檢測效率問題，適合超聲破碎的條件優化或日常實驗中的質量監控，為相關研究人員提供了又一實用工具。