云南紅河彝族人群CYP2C9和VKORC1基因突變頻率與華法林維持劑量的關系*

婁云麗,熊 浩,歐海波,錢孟佼,劉 旭

(1.云南省滇南中心醫院/紅河州第一人民醫院 a.病案統計科 b.心胸外科,云南 蒙自 661100;2.青島大學附屬醫院/青島大學附屬心血管病醫院心臟外科,山東 青島 266000)

華法林是心臟瓣膜置換術后的主要抗凝藥物,但治療劑量因種族和個體間的不同,差異較大[1],細胞色素P450 2C9基因(Cytochrome P450 2C9,CYP2C9)和維生素K環氧化物還原酶復合1基因(Vitamin K epoxide reductase complex 1 gene,VKORC1)所編碼的蛋白酶是主要的華法林代謝酶[2]。除CYP2C9*1野生型外,CYP2C9*2(C.430C>T)、CYP2C9*3(C.1075A>C)位點突變可導致CYP2C9酶的代謝活性減低[3];同時,VKORC1基因-1639 G>A位點突變的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)可解釋5%～28%的不同人群中華法林維持劑量的差異情況[4]。云南紅河地區彝族人口眾多,呈大雜居、小聚居的特點,少數民族間通婚和表親婚姻的現象較為常見,導致其基因型與內地漢族有較大差異[5,6]。本研究旨在探明紅河彝族CYP2C9、VKORC1基因突變頻率與華法林維持劑量的關系,為華法林的個體化給藥研究提供理論支持,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年10月-2021年10月在紅河州第一人民醫院就診的紅河州彝族心臟人工瓣膜置換術后的140例患者進行臨床資料匹配,數據納入實驗組,同時納入漢族人群作為對照組:共172例。收集外周血標本、收集臨床相關因素如:年齡、性別、體重、身高、國際標準化比值(international normalized ratio,INR)等相關臨床資料及華法林實際維持劑量(Acture Warfarin Dose,AWD),見表1。本研究所收集數據已經醫院倫理委員會批準。

表1 入組人群一般臨床資料

納入標準:(1)心臟瓣膜置換術后接受華法林抗凝治療;(2)華法林抗凝狀態平穩;(3)INR在1.5～3.0之間。排除標準:(1)患有血液系統疾病、出血性疾病或惡性腫瘤;(2)患有胃腸道活動性潰瘍或在近3個月內發生過消化道出血;(3)妊娠期和哺乳期婦女;(4)嚴重肝功能不全和腎功能不全患者;(5)華法林過敏;(6)患者依從性差,不配合完成隨訪者。

1.2 研究方法

實時熒光定量PCR反應體系檢測CYP2C9和VKORC1基因的多態性,根據反應曲線及△Ct值來確定樣本DNA的基因型。比較入組患者CYP2C9等位基因的突變位點(CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3)和VKORC1-1639G>A基因多態性的分布差異。本研究中,根據數據的正態性及方差齊性,對計數資料的檢驗采用了泊松檢驗,對計量資料分組檢驗采用了卡方檢驗、秩和比檢驗等方法,以上統計分析過程由Stata 16軟件完成。

2 結果

2.1 收集患者相應臨床資料,見表1。

2.2 所有入組患者行實時熒光定量PCR反應檢測

檢測CYP2C9和VKORC1-1639G>A的基因分型,見圖1。

圖1 患者CYP2C9和VKORC1-1639G>A基因分型PCR擴增反應曲線

2.3 分析遺傳基礎信息

紅河彝族居民體表面積(Body Surface Area,BSA)均值為:1.56±0.16m2,較漢族人群偏低(P<0.001)。紅河州彝族居民 INR均值為:1.86±0.92,低于漢族人群的2.33±0.40(P<0.001);紅河州彝族居民高血壓與心臟病患病率均低于漢族人群(P<0.001);彝族人群NYHA3級低于漢族人群,而NYHA4級要比漢族人群偏高;華法林實際劑量2組人群無明顯差異,見表2。

表2 2組組人群遺傳基礎信息及INR值的比較

2.4 分析2組人群中CYP2C9突變位點和VKORC1-1639 G>A基因分型的分布差異

CYP2C9*1/*1及VKORC1-1639 AA的基因分型為研究人群中的主要構成;但漢族人群中的VKORC1-1639 AA純合突變率要高于紅河彝族人群中(P<0.001),見表3。

表3 CYP2C9突變位點和VKORC1-1639G>A基因分型在2組人群中的分布差異

2.5 進一步分析不同的CYP2C9突變位點和VKORC1-1639 G>A基因分型是否會對不同人群的AWD值產生差異影響

結合上述基因分型特點,構建患者AWD值的分布箱式圖,見圖2;CYP2C9*3位點突變包括:*1/*3突變雜合和*3/*3突變純合,由于突變頻率低,合并為CYP2C9*3(*1/*3、*3/*3)+VKORC1 AA基因分型,其AWD值總體分布在1.75～2.50mg/d(中位數);而對于CYP2C9*1/*1+VKORC1 AA的主要基因分型,2組人群AWD值總體分布在2.0～3.0mg/d(中位數);CYP2C9*1/*1+VKORC1 GA基因分型,2組人群AWD值總體分布在3.0～4.0mg/d(中位數),見圖2。方差分析發現:不同基因分型,2組人群中AWD值的分布并無統計學差異,見表4。

圖2 AWD值分布情況箱式圖

表4 2組人群中不同CYP2C9+VKORC1-1639 AA基因分型中華法林AWD均值比較

3 討論

3.1 不同民族華法林相關代謝基因的突變情況

華法林抗凝的靶點是競爭性抑制VKORC1亞基,而VKORC1-1639 G>A的突變,可導致VKORC1表達減少,從而使維生素K的循環利用減少,維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性降低,使華法林抗凝劑量的需要量明顯減少[3];同時,CYP2C9*2、*3的突變,可導致細胞色素CYP2C9酶轉錄后在肝臟中的代謝活性分別降低30%、80%[7],使患者所需華法林AWD值減少。有文獻報道:白種人群CYP2C9*2(C.430C>T)突變率為22%[8],亞洲人群里,中國及東亞人群并沒有發現CYP2C9*2突變等位基因或突變頻率極低[9-11],而南亞印度多個地區CYP2C9*2的突變頻率波動較大,在1.2%～9.6%左右[12],CYP2C9*5、*6、*8 和 *11常見于非洲人群[13,14];VKORC1 1639G>A突變頻率在白種人群中為65%～75%左右,中國人群中為99%,而南亞印度的突變頻率卻明顯要低得多,且南北地區的波動幅度在11.7%～31%左右,可能與印度國內種族較多有關聯[12]。因此,由于地域、人種等的不同,CYP2C9及VKORC1 1639G>A突變頻率差異較大,是導致華法林抗凝劑量差異大的原因之一[15]。

本文僅在漢族人群中發現1例CYP2C9基因*1/*2的雜合突變(突變率0.005%)和 2例VKORC1 GG的野生純合型(其G>A突變率98%),盡管民族上有一定差異,但紅河少數民族居民在上述兩個基因表型上,與東亞人群并無太大差別,與以往對我國人群的研究結論一致[16,17]。從結果中可以看出:盡管漢族人群中的VKORC1-1639 AA純合突變率要高于紅河彝族人群,而考慮到每個患者做為一個完整個體,是無法把這兩個代謝相關基因表型的差異對華法林維持劑量的影響作用分開來進行評價,所以通過箱式圖分布得到進一步的驗證,CYP2C9*1/*1+VKORC1 AA的主要基因分型,AWD值總體均分布在2.0～3.0mg/d,但2組人群比較無顯著差異。這一現象說明:僅靠華法林代謝基因CYP2C9和VKORC1多態性的單一遺傳因素并不能準確預測華法林的實際劑量。

3.2 華法林代謝的影響因素

紅河州彝族合并高血壓、冠心病及術后心功能3級(NYHA分級)患者要低于漢族人群,此因素也可能會對華法林的代謝造成不同影響;與Qian等[18]研究紅河少數民族人群的基因分布情況的結論相一致,需根據多重線性回歸等方式對相應少數民族人群的因素進行多元分析,構建相應的華法林劑量預測公式,才能讓華法林抗凝治療能夠更精準地應用于上述少數民族人群。值得注意的是:入組的病例均為無出血或栓塞不良事件的穩定劑量患者,而紅河州彝族患者INR值波動在:1.76±0.45～1.95±1.04,低于漢族人群2.28±0.45～2.64±0.67(P<0.001),INR值維持在2.0～3.0時,接受華法林抗凝治療的患者不易發生出血、栓塞等嚴重并發癥[19],是否可以推測:紅河州彝族居民接受抗凝治療時,若增加華法林口服劑量,使其INR值達到漢族人群的水平,是否會出現出血的嚴重并發癥,這值得筆者在后續工作深入研究。

本研究提示:高原地區居民長期處于低氧環境,存在凝血功能激活狀態,當創傷、手術等應激作用后,血小板及凝血因子的大量消耗,可導致機體處于低凝狀態,出血風險增加[20,21]。云南省紅河哈尼族彝族自治州地形以山區為主(占85%),平均海拔高度在1300～1600m左右,屬于典型的亞高原地區,具有高原地區的低氣壓、缺氧和高紫外線輻射等特點[22,23]。因而,在分析紅河州居民華法林維持劑量的影響因素時,是否也需要把亞高原地區作為影響因素進行分析,是下一階段筆者所要考慮的一個問題。

綜上所述,紅河彝族人群以CYP2C9*1/*1野生純合型及VKORC1-1639 AA突變純合的基因型為主,與東亞人群無明顯差別;AWD值總體分布在2.0～3.0mg/d,雖然彝族VKORC1-1639 AA純合突變率低于漢族人群;僅靠CYP2C9和VKORC1代謝相關基因的遺傳多態性并不能準確估算華法林的實際劑量,針對彝族人群基因多態性、體表面積、合并疾病及環境等多因素等建立精準的華法林劑量預測模型,值得本文在后續研究中深入討論。