Xpert MTB/RIF與結核分枝桿菌利福平耐藥表型檢測一致性分析

茹浩浩 陳連勇 楊 星 陳 濤 閆雙群 許 琳

（云南省疾病預防控制中心結核病防治所，云南 昆明 650022）

Xpert MTB/RIF是一種檢測結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）及其利福平（rifampicin，RFP）耐藥性的半巢式實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測技術。這一技術是針對rpoB基因81 bp的利福平耐藥決定區（rifampicin resistance determining region，RRDR）設計引物和探針，檢測其是否發生突變，進而診斷患者是否感染MTB，以及是否對RFP耐藥[1]。有研究發現，Xpert MTB/RIF檢測RFP耐藥性具有較高的敏感性和特異性，與表型藥物敏感性試驗（phenotypic drug susceptibility test，pDST）結果有較好的一致性，但也存在耐藥結果不一致的情況[2]。異質性耐藥，即分離自患者樣本的菌株中，既有敏感株，又有耐藥株，是導致表型和基因型耐藥檢測結果不一致的主要原因[3]，全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）可以發現這種異質性耐藥[4]。為了了解Xpert MTB/RIF檢測RFP耐藥性和pDST結果的一致性，并分析2種方法檢測結果不一致的原因，本研究對2020年云南省耐藥監測中行Xpert MTB/RIF檢測的672株MTB進行比例法pDST。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2020年云南省耐藥監測中行Xpert MTB/RIF檢測的672株MTB。Xpert MTB/RIF檢測由云南省耐藥監測點實驗室完成，并將結果匯報至云南省疾病預防控制中心結核病參比實驗室。收集患者基本信息和相關實驗室檢測結果。

1.2 儀器和試劑

改良中性羅氏培養基、含藥羅氏培養基購自珠海貝索生物技術有限公司。RFP藥物培養基內藥物終濃度為40 μg/mL。

1.3 方法

1.3.1 菌種鑒定和藥物敏感性試驗

采用比例法進行pDST。以MTB標準株（H37Rv）作為敏感對照，標準株由中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供。

1.3.2 測序

菌株滅活后，委托上海晶諾生物科技有限公司提取DNA并進行測序，測序平臺為美國Illumina公司Illumina二代測序平臺，雙端測序，測序平均深度100×以上。

1.3.3 WGS數據分析

用TB-profiler V4.0.3（https：//github.com/jodyphelan/TBProfiler/）分析測序Fastq原始數據，獲得菌株的耐藥基因突變特征。采用Trimmomatic軟件進行質控（去除接頭、引物序列、低質量序列），以H37Rv標準菌株為參考序列，用BWA和Samtools軟件進行比對和排序，GATK4軟件標記PCR重復，獲得bam文件，導入IGV V2.12軟件，參照H37Rv標準菌株序列，查看是否存在異質性耐藥的情況[5-6]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。計數資料以例或率表示。以pDST結果為金標準，采用四格表分析Xpert MTB/RIF檢測RFP耐藥的敏感性和特異性。

2 結果

2.1 Xpert MTB/RIF與pDST結果的一致性

672株MTB中，有36株pDST結果為RFP耐藥，其中Xpert MTB/RIF耐藥34株、敏感2株。636株pDST結果為RFP敏感菌株中，Xpert MTB/RIF耐藥17株、敏感619株。672株MTB中，有594株分離自初治患者，78株分離自復治患者。以pDST結果為標準，672株MTB的RFP耐藥率為5.36%；初治患者菌株耐藥率為3.87%（23/594），復治患者菌株耐藥率為16.67%（13/78），Xpert MTB/RIF檢測RFP耐藥性的敏感性為94.44%、特異性為97.32%、陽性預測值為66.67%、陰性預測值為99.52%。Xpert MTB/RIF檢測初治患者RFP耐藥的敏感性為95.65%、特異性為98.25%；Xpert MTB/RIF檢測復治患者RFP耐藥的敏感性為92.31%，特異性為89.23%。見表1。

表1 初治和復治患者Xpert MTB/RIF與pDST結果一致性 例

2.2 Xpert MTB/RIF與pDST不一致結果WGS分析

672株MTB中，有19株（2.83%）Xpert MTB/RIF與pDST結果不一致。2株Xpert MTB/RIF顯示RFP敏感，pDST顯示耐藥菌株中，有1株未檢出耐藥突變，1株檢出rpoB-Ile491Phe突變；17株Xpert MTB/RIF顯示RFP耐藥，pDST顯示敏感的菌株中，檢出rpoB-Leu452Pro突變、rpoB-Ser450Leu突變各4株，rpoB-Leu430Pro突變3株，rpoB-His445Asn突變2株，rpoBAsp435Tyr突變、rpoB-His445Asp突變、rpoBHis445Ser突變和rpoB-Ser450Trp突變各1株。共18株MTB發生RFP耐藥相關突變，在突變位點完全純合的MTB有6株，其余12株均有1～3個短序列（reads）為野生型（即未發生突變），未發生突變的reads所占比例最高[1.56%（3/192）]。1株未檢出RFP耐藥相關突變的MTB，在rpoB基因RRDR區也未發現明顯的異質性耐藥。另外，18株WGS檢出RFP耐藥相關突變的菌株中，有10株同時檢出其他藥物耐藥相關突變：包括氟喹諾酮耐藥相關gyrA基因突變4株，異煙肼耐藥相關ahpC、fabG1、katG基因突變5株，阿米卡星耐藥相關rrs-1401A＞G突變1株；其他8株僅發生RFP耐藥相關突變（rpoB-452位點突變3株，rpoB-450位點突變3株，rpoB-445位點突變1株，rpoB-430位點突變1株）。部分（2株）rpo-450突變菌株突變位點可視化圖見圖1。

圖1 部分（2株）rpoB-450突變菌株突變位點可視化圖

3 討論

本研究中，Xpert MTB/RIF與pDST檢測RFP耐藥結果有較好的一致性。以pDST結果為標準，Xpert MTB/RIF檢測RFP耐藥有較高的敏感性和特異性，在初治患者和復治患者中敏感性均較高，在復治患者中的特異性稍低于初治患者，與其他研究結果[7-8]一致，提示無論對于初治患者，還是對于復治患者，Xpert MTB/RIF檢測RFP耐藥均有較好的效能。

本研究中，2株Xpert MTB/RIF顯示RFP敏感、pDST顯示耐藥的MTB中，WGS未檢出耐藥突變1株，提示可能存在已知RFP耐藥突變以外的其他類突變或外排泵機制；另外，有1株為rpoB-Ile491Phe突變，該突變位于RRDR外，屬于罕見突變，因在Xpert MTB/RIF檢測靶點范圍外，故未被檢測到。17株Xpert MTB/RIF顯示RFP耐藥、pDST顯示敏感的MTB中，WGS均檢出RFP耐藥相關的rpoB基因突變，其中rpoBLeu452Pro突變4株、rpoB-Leu430Pro突變3株。王希江等[9]發現，rpoB-452位點突變對應低濃度耐藥，不建議將rpoB-Leu430Pro突變列為RFP耐藥相關突變。本研究有10株MTB雖然發生rpoB-Ser450Leu等RFP中、高濃度耐藥突變[9]，但pDST結果依然為RFP敏感，原因可能為：1）pDST雖然是藥物敏感性試驗的金標準，但比例法pDST為手工操作，受操作者、試劑、環境等因素的影響，結果可能存在一定誤差；2）異質性耐藥。本研究有18株檢出RFP耐藥相關突變的MTB中，突變位點完全純合的有6株，其余12株中均未發生突變的reads所占比例最高[1.56%（3/192）]，提示這些菌株中雖然普遍存在較低的異質性，但發生RFP耐藥相關突變菌群的比例遠大于敏感菌群，而比例法pDST理論上可以檢測出耐藥亞群比例≥1%的耐藥菌[4]。這些菌株雖然發生了rpoB-Ser450Leu等中、高水平耐藥突變，但pDST結果依然為RFP敏感的主要原因可能是pDST的不穩定性，而不是異質性耐藥。

綜合以上結果，Xpert MTB/RIF與pDST檢測RFP耐藥結果不一致時，除Probe A探針突變外（包含rpoB-430位點），只要其中1種方法顯示RFP耐藥，均應視為耐藥。根據這個原則，結合WGS結果綜合判斷，本研究中可判定RFP耐藥的MTB為50株，據此判斷，Xpert MTB/RIF檢測RFP耐藥性的敏感性為96.00%、特異性為99.52%，陽性預測值為94.12%，陰性預測值為99.68%。與本研究類似，國外也有研究證實Xpert MTB/RIF與基因測序檢測RFP耐藥結果的一致性高于pDST，Xpert MTB/RIF與pDST中RFP耐藥結果不一致的樣本通過參考基因測序結果進行校正后，敏感性和特異性也有一定的提升[8]。既往研究中，因為在低RFP耐藥率患者中較低的陽性預測值，往往認為Xpert MTB/RIF應優先用于RFP耐藥率較高的定點醫院，以及耐多藥高危人群[2]。本研究藥物敏感性以綜合判定結果為金標準，校正Xpert MTB/RIF檢測RFP耐藥性的陽性預測值為94.12%，這說明在RFP耐藥率較低的人群中，Xpert MTB/RIF檢測獲得的RFP耐藥結果比較可靠。同時，根據綜合判斷，RFP耐藥率為7.44%（50/672），比僅依靠pDST的RFP耐藥率[5.36%（36/672）]提高了2.08%。既往云南省耐藥監測主要參考pDST結果，所以RFP耐藥率可能在一定程度上被低估。全國范圍的大樣本量的數據也證實WGS檢測到的幾乎所有藥物的耐藥率都高于pDST[10]，而既往云南省耐藥監測中RFP耐藥率為6.38%～8.71%，耐多藥率為3.78%～7.46%[11-13]，根據2016年的數據[12]，推測云南省實際的R F P 耐藥率約為8.00%，提示未來有必要將WGS應用到耐藥監測中，以提高結果的準確性。

此外，本研究17株Xpert MTB/RIF顯示RFP耐藥而pDST顯示RFP敏感的菌株中，有8株僅發生RFP耐藥相關突變（rpoB-452位點突變3株，rpoB-450位點突變3株，rpoB-445位點突變1株，rpoB-430位點突變1株），占47.06%。提示有可能合并發生了其他藥物耐藥相關突變菌株的RFP耐藥水平要高于僅發生RFP耐藥相關突變的菌株，這需要后續研究通過最低抑菌濃度法藥物敏感性試驗和WGS相結合來進行驗證。