GEO芯片分析聯合網絡藥理學探討青風藤治療特發性膜性腎病的作用機制

江宜宏,鄭佳新

(黑龍江省中醫藥科學院,黑龍江 哈爾濱 150036)

膜性腎病是成人腎小球腎炎的一種常見類型,根據病因分為特發性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)和繼發性膜性腎病(secondary membranous nephropathy,SMN),其中75%表現為IMN,SMN多由臨床疾病發展而來[1]。IMN具有病程反復、遷延難愈的特點,約80%的IMN患者臨床表現為腎病綜合征[2],目前臨床治療上主要依賴于激素、免疫抑制劑、ACEI和ARB類等藥物[3]。然而,長期的西藥治療不僅給患者家庭帶來巨大的經濟負擔,而且治療后仍存在復發的可能,甚至伴隨著嚴重的副作用。

中藥青風藤最早被用于治療類風濕性關節炎,大量研究證實青風藤具有抗炎、鎮靜、鎮痛作用,對非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫均有抑制作用[4-5]。近年來,青風藤及其復方不斷被應用在治療膜性腎病等腎臟疾病上,臨床上取得了顯著療效,但其具體作用機制尚未明確。本研究利用基因表達綜合數據庫(gene expression omnibus,GEO)對IMN相關差異表達基因進行分析,同時借助網絡藥理學探討青風藤治療IMN的關鍵靶點及相關通路,為進一步研究青風藤治療IMN提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫及數據處理工具 本研究所用數據庫包括TCMSP、GEO、Uniprot、STRING、DAVID 6.8、KEGG、PDB,數據處理工具包括Venny 2.1.0 在線平臺、Cytoscape 3.9.0軟件、Origin Lab 2020軟件、Auto Dock1.5.7軟件、Pymol軟件、Open Babel軟件。

1.2 青風藤活性成分及對應靶點 在 TCMSP數據庫中輸入青風藤,設置條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug like,DL)≥0.18,篩選出符合條件的青風藤活性成分及其對應的蛋白質靶點,并根據已發表的文獻報道補充未預測到的活性化合物的已知靶點。篩選結束后,為規范青風藤活性成分及對應蛋白質靶點,借助Uniprot數據庫(https://www.Unipmt.org)進行匹配規范。

1.3 青風藤“活性成分-靶點”網絡的構建 將篩選到的青風藤成分和靶點導入Cytoscape軟件,構建青風藤“活性成分-靶點”可視化網絡,利用cytoNCA插件分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數,包括Dgeree、Betweenness等,并根據網絡拓撲學參數判斷核心靶點和發揮藥效的主要活性成分。

1.4 IMN差異表達基因篩選 基因數據來源于GEO數據庫中的GSE115857芯片。該芯片數據包含7例健康活體捐贈者和11例IMN患者的腎臟組織基因表達量,以P<0.05且|log FC|≥1為條件篩選差異表達基因。

1.5 靶點蛋白質相互作用網絡(PPI)構建 利用在線平臺Venny 2.1.0將青風藤藥物靶點與IMN靶點匹配取交集并繪制韋恩圖,采用STRING數據庫(http://string-db.org/)對獲得的交集靶點之間的相互作用進行分析,物種設置為“Home sapiens”,最小相互作用閾值設定為0.4,隱藏離散靶點,其他參數保留默認值,得到PPI網絡,并通過Cytos Scape 3.9.0中的MCODE插件對PPI網絡進一步分析,以degree值大小設置節點大小及顏色,分析其主要靶點基因。

1.6 GO靶點功能注釋和KEGG通路富集分析 使用DAVID數據庫對青風藤治療IMN的靶點進行基因生物學富集分析(gene ontology,GO)和基因組通路富集分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG),設置閾值P<0.05,保存數據結果并借助Origin Lab 2020對數據進行可視化。

1.7 分子對接驗證活性成分-關鍵靶點 根據上述分析結果,從TCMID數據庫下載青風藤活性成分的SDF格式文件,經Open Babel軟件轉化為MOL 2格式文件。使用PDB數據庫篩選獲取青風藤核心靶點的3D結構,然后將文件導入Py Mol軟件中進行去水、加氫、刪除配體等處理,設置分子對接的活性口袋,利用Auto Dock Vina 軟件將受體(靶點)與配體(活性成分)進行半柔性對接,預測兩者的結合性能,從而驗證本研究結果的準確性,并利用Py Mol軟件繪制對接結果圖。

2 結果

2.1 青風藤活性成分和靶點的獲取 初步提取青風藤化學成分16種,經過篩選后獲得6種活性成分,見表1。根據青風藤活性成分,經過去重和排除非人類靶點蛋白后,共得到52個靶點,并獲得其相應標準基因名。

表1 青風藤主要活性成分Table 1 The main active ingredient of Caulis Sinomenii

2.2 青風藤 “活性成分-靶點”網絡的構建 將篩選出的靶點導入Cytoscape軟件3.9.0,構建青風藤“活性成分-靶點”網絡,見圖1。該網絡包含了59個節點和112條邊,其中矩形、菱形和圓形分別代表青風藤、活性成分和對應靶點蛋白。根據degree值排名前4位的分別是β-谷甾醇(beta-sitosterol)、左旋千金藤啶堿(stepholidine)、拉茲馬寧堿(16-epi-Isositsirikine)和青藤堿(sinomenine),可能是青風藤起治療作用的主要成分。

圖1 青風藤“活性成分-靶點”網絡圖Figure 1 “Active ingredient-arget” network diagram of Caulis Sinomenii

2.3 IMN差異表達基因的獲取 以P<0.05且|log FC| ≥1為標準對GEC115857芯片數據進行整理和分析,得到差異表達基因共3 983個。

2.4 核心靶點及靶點PPI網絡分析 將青風藤活性成分靶點和IMN差異表達基因取交集得到青風藤-IMN共同靶點8個,見圖2。對共同靶點構建PPI網絡,并運用Cytoscape軟件對PPI網絡進一步分析,見圖3。此網絡中包含13個節點和31條邊,圖中節點大小代表該靶點作用強度,degree 值越高,節點越大,對應顏色越深,其相關靶標蛋白重要性排名見表2。說明青風藤治療IMN作用機制復雜,非單一蛋白靶標作用而成。

圖2 青風藤活性成分-IMN靶點Venn圖Figure 2 Venn diagram of active ingredient of Caulis Sinomenii and IMN

圖3 青風藤-IMN核心靶點互作網絡Figure 3 Core target interoperability network of Caulis Sinomenii and IMN

表2 青風藤治療IMN關鍵靶點Table 2 Caulis Sinomenii treatment of IMN key targets

2.5 靶點功能與通路的分析 應用DAVID數據平臺對青風藤治療IMN相關靶點進行信號通路分析,并對數據進行可視化處理。由結果可見多個靶點參與了細胞凋亡過程,見圖4;參與的通路主要有MAPK通路、cAMP通路和癌癥相關通路等,見圖5。

注:BP.生物學過程(biological process);CC.細胞定位(cellular component);MF.分子功能(molecular function)。圖4 青風藤治療IMN的GO分析圖Figure 4 GO analysis of the treatment of IMN by Caulis Sinomenii

2.6 分子對接結果 選擇青風藤活性成分和PPI網絡中degree前5的核心靶點進行分子對接,結果見表3。根據對接得分判斷青風藤活性成分與核心靶點的結合性能,結合能≤ -5.0 kJ/mol說明活性成分與靶點對接效果較好。對接結果顯示,藥效成分與核心靶點的最低結合能均小于0 kJ/mol,說明受體與配體間可以自發結合,其中JUN蛋白與各成分的對接結合能均小于-5.0 kJ/mol,CASP3蛋白、CASP8蛋白、EP300蛋白、和RIPK1蛋白與β-谷甾醇、甘露聚糖、烏心石環氧內酯的對接結合能均小于-5.0 kJ/mol 。對對接結果進行可視化,結果見圖6。

3 討論

IMN 是Th2 介導的體液免疫所致,導致以IgG4 為主的原位免疫復合物在GBM上皮細胞側形成,并激活補體,導致膜攻擊復合物(C5b-9)刺激足細胞釋放炎癥介質引起蛋白尿和GBM損傷[6],不少學者認為IMN應屬一種自身免疫性疾病。青風藤味苦、辛,性味平,歸肝、脾經,具有祛風濕、通經絡、利小便的功效,常作為主要藥物出現在IMN的中藥治療中,在改善腎功能、減輕蛋白尿方面療效肯定[7]。

本研究篩選出青風藤的有效成分6個,其主要活性成分包括β-谷甾醇、左旋千金藤啶堿、青藤堿和拉茲馬寧堿。β-谷甾醇是植物甾醇的重要組成成分,通過上調γ-干擾素和下調白介素-6、腫瘤壞死因子-α發揮抗炎作用[8]。青藤堿可通過調控足細胞自噬相關的信號通路,引起應激性的細胞自噬,對腎臟發揮保護作用[9]。左旋千金藤啶堿主要作用于多巴胺受體[10]。拉茲馬寧堿相關研究文獻較少,主要涉及腫瘤抑制方面的作用。青風藤的主要成分對于機體炎癥及細胞凋亡均有相應作用。

進一步對青風藤與IMN的共同靶點進行分析研究,結果顯示青風藤對IMN起治療作用的主要靶點為JUN、CASP3、CASP8、EP300。JUN是一種轉錄因子,主要調控炎癥因子和金屬蛋白酶(MMPs)[11],參與細胞增殖、分化、凋亡,影響機體的免疫和炎性反應[12]。CASP3是青風藤治療IMN的一個重要靶點,CASP3被認為是即將死亡或因細胞凋亡而死亡的細胞的可靠標記,通過對細胞凋亡過程中的大部分蛋白水解參與細胞凋亡途徑[13]。此外對CASP3缺陷小鼠的研究發現,小鼠腎臟顯示增殖性腎小球病變,系膜區域出現 IgA 和補體3的免疫復合物沉積,足細胞損傷和腎小管間質中存在炎性細胞浸潤,提示CASP3可能在膜性腎病的發病機制中具有雙重調節作用[14]。CASP8是細胞凋亡的分子開關,可抑制 RIPK3和 MLKL介導的壞死性凋亡,藥物可通過抑制CASP8的活性降低RIPK3和MLKL水平阻斷壞死性凋亡[15]。EP300作為相互作用分化抑制因子主要在癌癥中表達,EP300突變上調了參與免疫系統的信號通路,其可能通過增強自身抗免疫能力起到治療IMN的作用[16]。這表明青風藤介導的主要靶點可通過調控人體免疫系統,減少腎小球基底膜免疫復合物沉積,抑制炎癥因子釋放等起到治療IMN的作用。分子對接驗證結果亦表明β-谷甾醇、左旋千金藤啶堿、青藤堿及拉茲馬寧堿與主要靶點(JUN、CASP3、CASP8、EP300)的結合活性較強。

本研究發現關鍵靶點的GO功能分析主要集中在凋亡信號、對脂多糖的反應、神經元凋亡過程的正調控、細胞凋亡執行階段的細胞成分分解等生物學過程。KEGG富集分析結果顯示青風藤治療IMN的通路主要有MAPK信號通路以及cAMP信號通路。MAPK信號通路包括三個亞組:ERK、p38、JNK。ERK激活可促進表皮生長因子受體(EGFR)的上調表達,促進對細胞免疫至關重要的自分泌生長環,對ERK-MAPK信號的抑制劑研發是目前治療自身免疫性疾病的新方向[17]。p38是MAKP信號通路的主要分支之一,p38通路通過產生大量不同的生物效應對細胞外部信號做出適當反應[18]。JNK直接參與細胞凋亡的線粒體途徑,通過氧化應激激活JNK致使半胱天冬酶活化和凋亡,從而誘導細胞凋亡[19]。cAMP通路是G蛋白偶聯受體 (GPCR) 觸發的信號級聯反應,它們會介導心臟和骨骼肌的上皮細胞功能和生理機能[20]。IMN 是一種免疫復合物相關的腎小球疾病,其與自身免疫系統問題密切相關;cAMP 通路可作為自身免疫性疾病和炎癥性疾病的治療靶點[21],故青風藤或許可成為單味中藥免疫抑制劑的一種選擇。

綜上,青風藤中的β-谷甾醇、左旋千金藤啶堿和青藤堿等主要活性成分可能通過抑制MAPK、cAMP等信號通路作用于JUN、CASP3、CASP8等疾病靶點發揮抗炎癥因子、調控細胞凋亡等生物功能,抑制足細胞損傷,從而起到保護腎臟,治療IMN的效用。研究結果表明青風藤具有多通路,多靶點調控的特點,為臨床運用青風藤治療IMN提供了科學依據,也為進一步發掘青風藤潛在作用機制提供了新的方向。