夏桑菊浸膏對高滲誘導干眼模型人角膜上皮細胞保護機制研究

李進良,胡雙飛,李沛波,吳灝,彭維,蘇薇薇,王永剛,孫維廣

(1.中山大學生命科學學院,廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室,廣東 廣州 510275;2.廣州白云山星群<藥業>股份有限公司,廣東 廣州 510288)

干眼癥(dry eye disease,DED)是一種常見的眼部疾病,其發病率逐年上升,嚴重影響了患者的正常生活和工作[1]。目前,雖然有多種治療干眼癥的方法[2],但病因復雜,如藥物依賴、病情反復等問題,治療效果并不理想[3]。因此,亟須尋找或開發一種更加安全有效的治療方法。中藥用于治療眼部疾病歷史已久,在治療眼部等疾病中具有獨特優勢。夏桑菊(Xiasangju)是一種傳統的中藥復方,常用于治療目赤腫痛、風熱感冒、流感等[4],因其治療目赤腫痛效果較好,提示其具有治療干眼癥潛力。然而,夏桑菊用于治療干眼癥鮮有報道。現代藥理學研究表明,夏桑菊具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學效應[5]。夏桑菊中的桑葉、野菊花能有效改善瞼板腺功能障礙引起的干眼癥,且治療過程簡單易行、效果良好,但其作用機制尚未明確[6]。目前,淚液滲透壓升高引發的眼表炎癥已被認為是干眼癥的標志[7-9]。基于此,本研究采用人角膜上皮細胞,通過構建高滲透壓模型探究夏桑菊對人角膜上皮細胞的保護作用及機制,以期為干眼癥的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞HCE-T人角膜上皮細胞系(富衡生物,FH1239)。

1.1.2 主要試劑夏桑菊浸膏[廣州白云山星群(藥業)股份有限公司,批號：B220301];HCE-T專用培養基(富衡生物,FH-HCET);N-乙酰-L-半胱氨酸(蘭博利德,YXBG01-25G);氯化鈉(Sigma-Aldrich,S3014-500g)、白介素-18、白介素-6、白介素-1β檢測試劑盒均購于云克隆Cloud-clone;EZ-press RNA Purification Kit(蘇州英澤生物醫藥科技有限公司,B0004D);迷迭香酸(中國食品藥品檢定研究院,批號：111871-202007)等。

1.1.3 主要儀器設備色譜柱：依利特 Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm,5 μm);HERAcell vios 160 CO2培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司);HT840超凈工作臺(蘇州凈化安泰技術有限公司);CytoFLEX流式細胞分析儀(CytoFLEX,Beckman);HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司);酶標儀(美國Bio Tek)、LC480實時熒光定量384孔PCR儀(瑞士Roche公司);Virit960梯度PCR儀(美國Applied Biosystems公司);Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件色譜柱：C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),檢測波長329 nm,流速0.9 mL·min-1,柱溫30 ℃,進樣體積 10 μL,按照《中國藥典》夏桑菊顆粒[10]中的流動相條件梯度洗脫。

1.2.2 細胞培養HCE-T細胞每2 d換液1次,細胞生長至近融合狀態時,用胰蛋白酶消化細胞并傳代。培養條件為HCE-T專用完全培養基,置于37 ℃,5% CO2培養箱中無菌培養。

1.2.3 MTS法檢測細胞活力細胞用不同濃度(30、50、70、90、110、130 mmol·L-1)NaCl分別模擬(350、400、450、500、550、600 mOsm·L-1)滲透壓及用不同夏桑菊生藥量濃度處理人角膜上皮細胞24 h,更換培養基,加入20 μL MTS孵育1～4 h后,采用酶標儀測定波長490 nm處吸光度(optical density,OD)值,按公式計算得各組的細胞活力：細胞活力=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.4 研究夏桑菊的保護作用實驗分設不同組,采用600 mOsm·L-1(130 mmol·L-1NaCl)滲透壓造模并同時給藥,MTS檢測細胞活力。

1.2.5 夏桑菊的保護作用機制研究

1.2.5.1 抗氧化作用使用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針檢測 ROS。將細胞以2×105個細胞/孔的密度接種在6孔板中,按照各自的處理培養24 h。在37 ℃下與10 μmol·L-1DCFH-DA 探針染料孵育30 min后,用PBS洗滌細胞兩次,流式細胞分析儀檢測。

1.2.5.2 抗炎作用①ELISA法檢測各組細胞培養液上清中炎癥因子IL-1β、IL-6及IL-18的質量濃度：細胞按實驗設計分組并做相應處理。每組處理24 h。檢測細胞培養液上清。

②實時熒光定量PCR法檢測夏桑菊浸膏對高滲誘導下人角膜上皮細胞相關基因的表達：細胞按實驗設計分組并做相應處理,處理24 h。提取總RNA,逆轉錄成cDNA后于-20 ℃條件下保存。采用實時熒光定量基因擴增儀擴增各組cDNA目的基因。IL-1β上游引物：CACGATGCACCTGTACGAT CA,下游引物：AGACATCACCAAGCTTTTTTGCT;GAPDH上游引物：ATGTTCGTCATGGGTGTGAA,下游引物：GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.2.6 統計學分析采用GraphPad Prism 8.0軟件分析實驗數據,結果采用單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 含量測定按上述色譜條件,將樣品進行處理和進樣分析,每份樣品平行進兩針,測定迷迭香酸峰面積,計算夏桑菊浸膏中迷迭香酸的含量,含量測定結果表明,檢測得到迷迭香酸含量為6 mg·g-1,高于《中國藥典》規定夏桑菊顆粒中迷迭香酸含量。

圖1 迷迭香酸對照品(A)和夏桑菊浸膏(B)的HPLC色譜圖

2.2 不同滲透壓對人角膜上皮細胞活力的影響MTS結果如圖2所示,不同滲透壓處理24 h,350、400、450 mOsm·L-1滲透壓對人角膜上皮細胞的活性影響無統計學意義,500～550 mOsm·L-1滲透壓降低了人角膜上皮細胞活性,分別降至70%和61%(P<0.01)。600 mOsm·L-1滲透壓可明顯降低其活性,低于37.6%(P<0.01)。

圖2 不同滲透壓對人角膜上皮細胞細胞活性的影響(N=3) 注：與正常對照組比較,#P< 0.05,##P < 0.01。

2.3 夏桑菊對人角膜上皮細胞活性的影響采用不同濃度夏桑菊處理24 h對人角膜上皮細胞,實驗見圖3,與正常對照組相比,夏桑菊濃度≥10 mg·mL-1時,對細胞活性具有顯著抑制作用;夏桑菊濃度<10 mg·mL-1,對細胞活性無顯著性影響。以10 mg·mL-1為最大濃度,設置多個濃度評價夏桑菊的藥效。由“2.2”項下結果可知,600 mOsm·L-1滲透壓能夠有效降低人角膜上皮細胞活力,因此后續選用600 mOsm·L-1滲透壓處理,以探究夏桑菊對細胞的保護作用;低于或等于450 mOsm·L-1滲透壓時,對人角膜上皮細胞的活性影響無統計學意義,故選用450 mOsm·L-1滲透壓造模探究夏桑菊浸膏對細胞的保護作用機制及遷移能力。

圖3 不同濃度夏桑菊浸膏對人角膜上皮細胞活性的影響結果(N=3) 注：與正常對照組比較,#P<0.05,##P<0.01。

2.4 夏桑菊浸膏對高滲誘導的人角膜上皮細胞的保護作用將人角膜上皮細胞在600 mOsm·L-1滲透壓培養基中培養24 h后,與正常對照組相比,600 mOsm·L-1組的細胞活力由100%降至43.5%(P<0.01)。與600 mOsm·L-1比較,0.625 mg·mL-1和1.25 mg·mL-1夏桑菊可有效提高人角膜上皮細胞活性,細胞活性由模型組的45%提高到67.3%和64.9%(P<0.01),如圖4所示。表明夏桑菊浸膏對高滲透壓所致的細胞活性降低具有抑制作用。

圖4 夏桑菊浸膏對高滲誘導的人角膜上皮細胞的保護作用的影響(N=3) 注：與正常對照組比較,##P<0.01;與600 mOsm·L-1組比較,*P<0.05,**P<0.01。

2.5 夏桑菊浸膏對高滲誘導下人角膜上皮細胞ROS水平的影響 HCE-T細胞在高滲誘導下,細胞系統中的氧化系統與抗氧化系統之間動態平衡失調,導致氧化損傷。由圖5可知,與正常對照組相比,450 mOsm·L-1組 ROS的生成明顯增多(P<0.01);與450 mOsm·L-1組相比,450 mOsm·L-1+625 μg·mL-1組和450 mOsm·L-1+1.25 mg·mL-1組細胞ROS的生成明顯減少 (P<0.01)。說明夏桑菊能夠有效抑制高滲誘導下人角膜上皮細胞 ROS水平升高,在一定程度上緩解高滲所致的氧化應激。

圖5 夏桑菊浸膏對高滲誘導的人角膜上皮細胞的ROS水平影響(N=3) 注：與正常對照組比較,##P<0.01;與450 mOsm·L-1組比較,**P<0.01。

2.6 實時熒光定量PCR法檢測夏桑菊浸膏對高滲誘導下人角膜上皮細胞IL-1β及Caspase-1基因的表達PCR結果顯示,450 mOsm·L-1組IL-1β、Caspase-1 mRNA的相對表達量與對照組相比升高 (P<0.01);與450 mOsm·L-1相比,450 mOsm·L-1+1.25 mg·mL-1組 mRNA的相對表達量降低(P<0.05),如圖6所示。研究表明夏桑菊能夠有效抑制高滲誘導下人角膜上皮細胞中IL-1β及Caspase-1基因表達。

圖6 夏桑菊浸膏對高滲誘導下人角膜上皮細胞IL-1β、Caspase-1基因的表達的影響(N=3) 注：與正常對照組比較,##P<0.01;與450 mOsm·L-1組比較,*P<0.05,**P<0.01。

2.7 夏桑菊浸膏對高滲誘導下人角膜上皮細胞分泌IL-6、IL-18、IL-1β水平的影響高滲誘導的氧化應激中 ROS 的產生,被認為是啟動 NLRP3 炎性體激活的關鍵觸發因素[9],隨著 NLRP3 炎性體激活,各種炎癥因子分泌水平易受影響,根據圖7分析,各組IL-6、IL-18、IL-1β的蛋白濃度差具有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比,450 mOsm·L-1組中的IL-6、IL-18、IL-1β蛋白濃度明顯升高(P<0.01);與450 mOsm·L-1組相比,450 mOsm·L-1+625 μg·mL-1組IL-6、IL-18、IL-1β的蛋白濃度明顯降低(P<0.01)。表明夏桑菊浸膏有效抑制了細胞中炎癥因子IL-6、IL-18、IL-1β的蛋白分泌。

圖7 夏桑菊浸膏對高滲誘導下人角膜上皮細胞分泌IL-1β、IL-18、IL-6水平的影響(N=3) 注：與正常對照組比較,##P<0.01;與450 mOsm·L-1比較,*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

在干眼癥發生過程中,角膜上皮細胞是最先受到水分流失影響的細胞,同時是眼中唯一暴露在外界環境中的細胞,處于高滲環境下,角膜上皮細胞易凋亡和屏障功能受損[11-15]。研究表明,夏桑菊浸膏中的多種活性成分,例如黃酮類、有機酸類化合物等,通過調節多種炎癥和氧化應激相關通路來發揮藥效作用[16]。具備眼部疾病保健、預防、醫療潛力[17]。陳安蘭等[18]將夏枯草及野菊花開發成雷菊滴眼液治療結膜炎,發現具有明顯的治療效果。魚俊杰等[19]采用中藥菊花、桑葉等制成清明眼藥水,治療電光性眼炎310例,總有效率99.97%。臨床結果表明,清明眼藥水是一種療效好、療程短的中藥滴眼劑。本研究通過構建高滲透壓模型,確定合適的夏桑菊的給藥濃度,給予高滲環境下人角膜上皮細胞合適夏桑菊浸膏的干預,發現夏桑菊可以抑制高滲誘導的人角膜上皮細胞活性下降,證明了夏桑菊保護人角膜上皮細胞免受高滲誘導的損傷的作用。初步揭示夏桑菊在治療高滲引起的干眼癥中具有藥效作用。

高滲引起的眼表炎癥已被認為是該病的特征之一[20]。本研究采用NaCl模擬高滲條件體外誘導干眼癥模型。在高滲刺激細胞后,其活性氧顯著增加,夏桑菊處理細胞后,ROS顯著減少,證明夏桑菊可以抑制人角膜上皮細胞中高滲誘導的ROS的增加。此外,高滲誘導細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-18的分泌水平增加,表明響應高滲應激產生的活性氧不僅會引發眼表氧化應激,將引發涉及炎癥級聯反應,導致各種促炎細胞因子和趨化因子的產生。而給予夏桑菊干預后顯著降低了炎癥因子的表達。體內研究顯示,在干眼癥患者的淚液和眼表中觀察到NLRP3炎癥小體的上調。高滲應激產生的活性氧可以激活小鼠干眼癥模型中的NLRP3炎性體[16]。進一步體外研究表明,活性氧誘導的NLRP3激活通過Caspase-1激活導致IL-1β分泌增加,突出了ROS-NLRP3-IL-1β 信號軸在干眼癥進展過程中的重要作用[21]。以上表明,夏桑菊可能通過抑制ROS-NLRP3-IL-1β信號通路來減輕干眼癥的炎癥反應。

綜上所述,夏桑菊浸膏可以保護高滲誘導的人角膜上皮細胞的損傷,這種保護作用可能與其抑制ROS升高及炎癥因子的表達有關,后續需對夏桑菊在干眼癥治療中的作用機制進一步深入研究,為其臨床應用提供更加可靠的依據。綜上,夏桑菊在干眼癥的治療中具有一定的潛力和應用價值。