澤瀉湯對高脂血癥模型小鼠CYP450酶亞型的影響

鞠愛霞,周育生,單萬亭,劉莉,李秋紅

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學藥學院,黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江省藥品檢驗研究院,黑龍江 哈爾濱 150088)

高脂血癥是誘發冠心病、心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病的主要危險因素之一,有效防治高脂血癥是預防心腦血管疾病發生的重要途徑。澤瀉湯出自《金匱要略》,由澤瀉、白術兩味中藥配伍而成,具有降血脂、抗高血壓、抗炎等作用[1]?！督饏T要略》原文記載：“心下有支飲,其人苦冒眩,澤瀉湯主之”。該方成分復雜、作用靶點多,在體內可能會影響細胞色素P450(CYP450)酶的活性或表達,進而對其他聯合應用藥物的代謝產生影響[2-3]。CYP450酶是非常重要的Ⅰ相代謝酶,可影響多種藥物在體內的代謝,具有多種亞型,易受性別、年齡、藥物、病理及生理狀態等因素影響[4]。因此,明確CYP450酶與中藥的相互作用關系對于合理配伍中藥、提高中藥療效、減少藥物的毒副作用至關重要。為探究澤瀉湯配伍規律及配伍的合理性,明確澤瀉湯及其拆方對高脂血癥模型小鼠CYP450酶亞型的影響,本研究以高脂血癥模型小鼠為基礎,分別采用“Cocktail”探針藥物法和qPCR技術,探究澤瀉湯全方及拆方對高脂血癥狀態下小鼠CYP450亞酶活性及基因表達量的影響,為澤瀉湯的合理應用及進一步開發提供數據支持。

1 材料

1.1 主要儀器LC-2010C型高效液相色譜儀(日本島津公司);Synergy MX型酶標儀(美國Biotek公司);StepOnePlus型實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);SmartSpec Plus型核酸蛋白濃度分析儀(上海艾研生物科技有限公司);AR2140型電子分析天平;DELTA320型pH計(梅特勒-托利多儀器公司);DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司);TGL16M型臺式高速冷凍離心機(長沙英泰儀器有限公司);BioSpectrum AC Chemi HR 410型UVP凝膠成像系統(美國);DYY-11B型三恒電泳儀(北京六一生物科技有限公司);BDF-86V50型-80 ℃冰箱(濟南卓隆生物科技有限公司)。

A.空白肝微粒體;B.空白肝微粒體+混合探針藥物+內標;C.給藥后肝微粒體+混合探針藥物+內標 1.咖啡因;2.氯唑沙宗;3.甲苯磺丁脲;4.地西泮圖1 混合探針藥物肝微粒體樣品色譜圖

1.2 主要藥品與試劑澤瀉、白術兩味中藥飲片均購自北京同仁堂哈爾濱藥店,經黑龍江中醫藥大學藥學院王振月教授鑒定飲片符合《中國藥典》2020年版(一部)標準;咖啡因對照品(批號：1108349)、甲苯磺丁脲對照品(批號：20110601)、氯唑沙宗對照品(批號：20110701)、睪酮對照品(批號：MB1636-S)均購自大連美侖生物技術有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：BL521A)購自北京蘭杰柯科技有限公司;瓊脂糖(批號：111860)購自北京維百奧生物科技有限公司;DEPC水(批號：20171204)、SuperRed/GelRed核酸染料(批號：21078812)、RNA上樣緩沖液(批號：6909624)、DNA上樣緩沖液(批號：70090500)、D2000 DNA Ladder(批號：21053625)、Taq plus Master Mix含染料(批號：70120054)、逆轉錄試劑盒(含DNase)(批號：21049684)均購自北京蘭杰柯科技有限公司;WCGENE mRNA qPCR定量試劑盒(批號：WC-SJH0002)購自上海沃吉基因科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜級。

1.3 實驗動物及飼養環境本研究所用動物為SPF級雄性KM小鼠,體質量為18～22 g,由遼寧長生生物技術股份有限公司提供,實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2020-0001,實驗動物使用許可證號：SCXK(黑)2018-007。將小鼠飼養于溫度(23±2) ℃、濕度45%～65%、12 h明暗交替的動物房中,飼養期間小鼠正常攝食和飲水。

2 方法

2.1 藥物制備澤瀉湯凍干粉：澤瀉、白術兩味中藥以5∶2的比例,等比例擴大,加入8倍量蒸餾水,浸泡30 min后,冷凝回流煎煮1.5 h,獲取藥液,再煎煮1 h,再次獲取藥液,過濾后,合并兩次濾液,濃縮。將濃縮后的水煎液倒入托盤,放入冷凍干燥機中,得到凍干粉,計算澤瀉湯凍干粉濃度為4.4 g·g-1。

澤瀉凍干粉：同澤瀉湯凍干操作方法,得到澤瀉凍干粉濃度為7.15 g·g-1。

白術凍干粉：同上述操作方法,得到白術凍干粉濃度為2.4 g·g-1。

2.2 分組、造模與給藥50只KM小鼠隨機分為空白組10只和高脂組40只,參考相關文獻[5]的方法建立高脂血癥模型,空白組飼喂基礎飼料,其余4組小鼠飼喂高脂飼料(配方組成：維持飼料65%、豬油10%,糖15%、奶粉5%、蛋黃粉5%),自由進食、飲水,飼喂6周后,當小鼠血清中TC>2.4 mmol·L-1時表示高脂血癥小鼠造模成功。造模結束后,澤瀉湯組、澤瀉組、白術組小鼠每天灌胃給藥持續28 d,小鼠給藥劑量根據澤瀉湯的成人用藥劑量采用體表面積表折算(澤瀉湯組、澤瀉組、白術組給藥劑量分別為12.0、8.6、3.4 g·kg-1),空白組、模型組均給予同體積生理鹽水。

2.3 取材末次給藥24 h后將大鼠頸椎脫臼處死,解剖取出肝臟用預冷的0.9% NaCl溶液沖洗肝臟表面血漬,稱量肝臟質量后,部分肝臟放入4%多聚甲醛中浸泡,剩余肝臟迅速置于液氮中固定,隨后放入冰箱-80 ℃保存備用。

2.4 小鼠肝臟中CYP450酶亞型酶活性檢測

2.4.1 肝微粒體混懸液的制備參考相關文獻[6],采用氯化鈣沉淀法在4 ℃環境中制備小鼠肝微粒體混懸液,防止肝藥酶失活變性,采用BCA法測總蛋白含量。

2.4.2 肝微粒體體系孵育及加樣流程肝微粒體體系(蛋白含量為0.4 mg·mL-1的小鼠肝微粒體,濃度為1 mmol·L-1NADPH,混合探針藥物(咖啡因15 μmol·L-1、甲苯磺丁脲20 μmol·L-1、氯唑沙宗20 μmol·L-1)/單一探針藥物(睪酮25 μmol·L-1及磷酸鹽緩沖液的總體積為500 μL的體系)孵育30 min后,加入4 ℃預冷含有8 μg·mL-1地西泮的甲醇終止液500 μL,混勻后,12 000 r·min-1離心15 min,取上清20 μL進入HPLC分析。

2.4.3 色譜條件肝微粒體中CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9酶活性測定的色譜條件：采用Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以0.05 mmol·L-1pH為3.4的甲醇：磷酸氫二銨緩沖溶液=56∶44(V/V)為流動相進行等度洗脫;檢測波長為230 nm;柱溫為30 ℃;流速為0.8 mL·min-1。

肝微粒體中CYP3A4酶活性測定的色譜條件：采用Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈∶水=50∶50(V/V)為流動相進行等度洗脫;檢測波長為245 nm;柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL·min-1。

建立了同時測定咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲3種探針藥物以及單獨測定睪酮的高效液相色譜法。

2.4.4 相對酶活性計算測定4種探針藥物咖啡因、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睪酮的峰面積,將其與內標地西泮峰面積的比值代入各探針底物的肝微粒體標準曲線中,計算出各探針藥物在樣品中的濃度。無活性組作為總底物濃度,其余各實驗組為剩余底物濃度,根據下式計算：相對酶活性=(總底物濃度-剩余底物濃度)/總底物濃度×100%。

2.5 小鼠肝臟中CYP450酶亞型相關基因表達檢測提取大鼠肝臟總RNA(參照動物總RNA快速抽提試劑盒說明書)進行質量檢測,隨后逆轉錄為cDNA。實時熒光定量PCR總反應體系為10 μL,包含上下引物各0.2 μL、5 μL SYBR Green、0.2 μL 50×ROX Reference Dye 2、2.4 μL 超純水以及2 μL cDNA模板。反應條件：95 ℃預變性10 min;40次循環(95 ℃變性15 s;60 ℃退火/延伸30 s);65 ℃到95 ℃每升高0.5 ℃采集一次熒光信號。引物由上海生工生物工程有限公司提供(見表1)。

表1 引物序列

3 結果

3.1 方法學考察專屬性考察結果表明,各色譜峰峰形尖銳,且分離度良好,各肝微粒體的內源性物質及內標地西泮在相應色譜條件下不干擾咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和睪酮的測定,該方法專屬性良好。該方法的靈敏度、準確度、精密度、穩定性均較高,滿足生物樣品的各項方法學考察要求。探針藥物之間以及與內標地西泮不產生相互干擾,能夠特異性檢測出各CYP450酶亞型的活性。肝微粒體樣品色譜圖見圖1～2。

3.2 澤瀉湯及其拆方對CYP450酶亞型酶活性的影響如表2所示,與空白組相比,模型組CYP2E1、CYP3A4酶活性顯著降低(P<0.01),CYP1A2、CYP2C9酶活性差異無統計學意義。與模型組相比,澤瀉湯組、澤瀉組、白術組均誘導了CYP3A4酶活性(P<0.01);澤瀉湯組、澤瀉組、白術組對CYP2E1酶活性有抑制作用(P<0.01或P<0.05);澤瀉湯組對CYP1A2酶有抑制作用(P<0.05);澤瀉湯組、澤瀉組、白術組對CYP2C9酶活性有抑制作用,但差異均無統計學意義(P>0.05)。

表2 澤瀉湯及其拆方對CYP450酶亞型酶活性的影響

3.3 澤瀉湯及其拆方對CYP450酶亞型基因表達的影響與空白組比較,模型組小鼠肝臟中CYP1A2、CYP3A4 mRNA表達水平均降低(P<0.05),模型組小鼠肝臟中CYP2E1、CYP2C9 mRNA表達水平無影響。與模型組相比,澤瀉湯組、澤瀉組小鼠肝臟中CYP1A2 mRNA表達水平均升高(P<0.05),白術組小鼠肝臟中CYP1A2 mRNA表達水平升高,但差異無統計意義;澤瀉湯組小鼠肝臟中CYP2E1 mRNA表達水平降低(P<0.05);澤瀉湯組、澤瀉組、白術組小鼠肝臟中CYP3A4 mRNA表達水平均升高(P<0.05);澤瀉湯組、澤瀉組、白術組小鼠肝臟中CYP2C9 mRNA表達水平無影響,結果見表3。

表3 澤瀉湯及其拆方對CYP450酶亞型基因表達的影響

4 討論

澤瀉湯臨床應用廣泛,也經常加味配伍使用或與其他藥物聯合使用,并且澤瀉湯成分復雜,與其他藥物聯合用藥時可能會發生配伍變化[7-9]。CYP450酶及其亞型是藥物在體內發生相互作用的關鍵因素,CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9是CYP450酶系的主要亞型,目前上市藥品經CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9酶代謝的達70%,因此,本研究選擇上述4個亞型進行研究。明確澤瀉湯及其拆方在疾病狀態下對CYP450酶亞型酶活性及基因表達量的影響,能夠使澤瀉湯在臨床上更合理地配伍使用,也盡量減少因藥物相互作用產生的不良反應。

根據文獻[10]和本課題組前期研究基礎選擇公認的探針藥物進行CYP450酶亞型酶活性測定,肝藥酶CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP3A4的特異性探針底物分別為咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、睪酮。探針藥物之間以及與內標地西泮不產生相互干擾,能夠特異性檢測出各CYP450酶亞型的活性。由于本次實驗探究了澤瀉湯對CYP450酶4個亞型的影響,設置單一陽性藥物對照對多個酶活性的探究意義不明顯,因此,本研究并未單設陽性藥物組。

對酶活性實驗結果分析發現,高脂血癥在動物水平可以顯著降低CYP2E1、CYP3A4酶活性,提示臨床上高脂血癥患者使用經上述兩種酶代謝的藥物時,應考慮給藥劑量,以避免造成藥物蓄積。他汀類藥物是具有代表性的一線降脂藥物,其經過CYP3A4酶代謝[11]。研究發現,阿托伐他汀治療攜帶CYP3A4*18B基因的患者比未攜帶者血藥濃度高,調脂療效更顯著[12]。因此,高脂血癥患者在服用阿托伐他汀等他汀類藥物降脂時,應進行治療藥物監測,防止產生藥物蓄積,避免出現橫紋肌溶解等嚴重不良反應[13-14]。本研究結果顯示,澤瀉湯全方及拆方逆轉了高脂血癥對CYP3A4酶活性的抑制作用。另有研究表明,CYP3A4酶與脂代謝相關[15],因此,澤瀉湯在對代謝酶產生影響的同時間接發揮了降脂作用,這也可能是其治療高脂血癥的機制,有待于進一步研究。研究表明,硝苯地平、氨氯地平等降壓藥物經CYP3A4代謝[16],與澤瀉湯合用時,由于澤瀉湯誘導CYP3A4酶,會加快硝苯地平在體內的代謝降低血藥濃度,進而影響藥效。格列本脲是臨床上常用的降糖藥物,其為CYP2C9的底物,而澤瀉湯抑制CYP2C9酶的活性,所以,當格列本脲與澤瀉湯同時使用時,會減少格列本脲在體內的代謝,增加其血藥濃度,提高藥效的同時可能會增加不良反應發生的風險。這些經CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9酶代謝的藥物與澤瀉湯聯合使用時,極易發生相互作用影響藥效,甚至會產生毒性反應。因此,當澤瀉湯與副作用或毒性較大的藥物聯合使用時,應進行血藥濃度監測,及時調整給藥劑量,避免發生不良反應。

本研究還采用實時熒光定量PCR檢測澤瀉湯及其拆方對CYP450酶亞型基因表達的影響。實驗結果表明,澤瀉湯全方及其拆方逆轉了高脂血癥對CYP3A4 mRNA表達水平的抑制作用,與其對酶活性的影響具有一致性,且單味澤瀉組與全方具有一致性,優于白術組,充分體現了澤瀉在澤瀉湯中的主導地位。同時,澤瀉湯和澤瀉還逆轉了高脂血癥對CYP1A2 mRNA表達水平的抑制作用。澤瀉湯抑制了高脂血癥小鼠CYP2E1 mRNA表達水平,與其對酶活性的影響一致,然而,單味澤瀉組和白術組雖抑制了CYP2E1 mRNA表達水平,卻對酶活性無影響。澤瀉湯全方及其拆方對CYP2E1酶活性和基因表達不一致,可能是由于基因轉錄和蛋白質翻譯受轉錄和翻譯后修飾的影響,多肽鏈合成很多但功能化不足導致酶活性與基因表達量不成正比。

本研究以CYP450酶為核心,探索了澤瀉湯及其拆方對高脂血癥模型小鼠CYP450酶亞型酶活性及基因表達量的影響,為澤瀉湯的合理應用及澤瀉和白術配伍研究提供了理論基礎,也為澤瀉湯的進一步研究提供新思路。