肝郁氣滯、肝膽濕熱型膽囊膽固醇沉著癥動(dòng)物模型建立與評(píng)價(jià)

王 彤,張 平,顏鑫園,蔡青原,陳建波,王雅蕾,劉文杰, 朱豆豆,王 旭,譚 琰,李建軍,姚成禮

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院,北京 100700;2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

膽囊膽固醇沉著癥是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病[1]。病理學(xué)上分為彌漫性膽囊膽固醇沉著癥(又名草莓膽囊)和膽固醇性息肉[2]。膽囊黏膜中膽固醇酯含量增高是其主要病變特點(diǎn),且膽固醇酯含量增高程度與膽汁膽固醇過(guò)飽和度呈正相關(guān)[3]。中醫(yī)學(xué)關(guān)于此類(lèi)疾病的命名、診療多是從癥狀角度出發(fā),被稱(chēng)為“脅痛”“膽脹”“膽癉”等。隨著我國(guó)物質(zhì)生活水平的日益提高和超聲診斷學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步[4],膽囊膽固醇沉著癥的發(fā)病率逐年升高[5]。但其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,更缺乏療效明確治療藥物[6]。無(wú)論是機(jī)制研究還是有效藥物評(píng)價(jià)都需要可靠的動(dòng)物模型[7]。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)該病的動(dòng)物模型研究較少,且尚無(wú)統(tǒng)一的建立標(biāo)準(zhǔn)與評(píng)價(jià)體系[8]。因此,本研究擬經(jīng)高脂高膽固醇飼料+正常飲用水法構(gòu)建膽囊膽固醇沉著癥小鼠模型,并對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡雄性C57BL/6J小鼠48只,體重(20±2)g。采用隨機(jī)數(shù)表法將小鼠分為空白對(duì)照組(WT)和造模3周組(LD-3)、造模6周組(LD-6)、造模9周組(LD-9)。WT組予普通飼料+正常飲用水喂養(yǎng),模型組分別給予3、6、9周高脂高膽固醇飼料+正常飲用水。高脂高膽固醇飼料組成：15%牛油、2%膽固醇、0.5%膽酸、82.5%普通飼料。以上組別的小鼠均自由飲食、水,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25±1)℃。小鼠購(gòu)買(mǎi)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,單位許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例,本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)批號(hào)：BUCM-4-2020031501-1025。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：1.25%阿弗丁(三溴乙醇0.625 g、阿拉丁1.25 ml、0.9%氯化鈉溶液50 ml,搖晃至溶解);三溴乙醇(北京翰隆達(dá)公司,T161626);叔戊醇(北京翰隆達(dá)公司,A103417);膽固醇(CHOL)測(cè)定試劑盒(IDEXX,011995);甘油三酯(TRIG)測(cè)定試劑盒(IDEXX,012308);無(wú)水乙醇(天津永大化學(xué)試劑有限公司,20201220);尼羅紅染色試劑(Sigma,72485);一抗鼠抗ABCA1(Abcam,ab66217);小鼠二步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,PV-9002);濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,ZLI-9017)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：Catalyst One動(dòng)物干式生化分析儀,廠家：美國(guó)愛(ài)德士(IDEXX)生物科技公司;傅里葉變換紅外光譜儀,廠家：美國(guó)Bruker公司;超速冷凍離心機(jī),廠家：德國(guó)Eppendorf公司;微量移液槍(無(wú)RNA酶),廠家：德國(guó)Eppendorf公司;全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀,廠家：奧地利Tecan公司;共聚焦顯微鏡,廠家：奧林巴斯;超分辨顯微鏡,廠家：德國(guó)徠卡公司;數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱,廠家：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;高精度電子天平秤,廠家：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本收集：腹腔注射1.25%阿弗丁,深度麻醉小鼠。眼眶取血,全血靜置1 h后,室溫4000 r/min離心15 min,取血清于-80 ℃冰箱冷凍,3 d內(nèi)檢測(cè)完畢。心臟灌流麻醉小鼠,0.9%氯化鈉溶液灌流,取新鮮膽囊組織,于-80 ℃冰箱凍存,用于膽汁成分分析。心臟灌流麻醉小鼠,0.9%氯化鈉溶液灌流,4%多聚甲醛灌流,取肝臟組織,用多聚甲醛固定,再于30%蔗糖溶液沉糖脫水,于4 ℃冰箱存放,用于制備石蠟切片。

1.2.2 血脂測(cè)定：將樣本血清從-80 ℃中取出后,在冰上融化,使用不含任何抗凝劑的移液槍吸取100 μl血清樣本,轉(zhuǎn)移到專(zhuān)用樣本杯,打開(kāi)全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀,輸入樣本信息,將總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)專(zhuān)用試劑片以及樣本杯放置于指定位置,啟動(dòng)分析儀,記錄數(shù)據(jù),回收剩余血清樣本。

1.2.3 尼羅紅染色：將膽囊組織放置于1 × PBS溶液中,用鑷子小心清除膽囊表面的脂肪組織,并用顯微眼科剪縱向剪開(kāi),室溫下用4%多聚甲醛PBS溶液固定30 min,孔板中加入0.05%尼羅紅的PBS溶液(1∶1000)與膽囊組織室溫共孵育30 min,注射器抽取ddH2O沖洗2次后75%甘油封片鏡檢,共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.4 紅外光譜分析膽汁成分：觀察膽囊的形態(tài)大小、膽汁的色澤情況并做好記錄。用持針器結(jié)扎膽囊管,眼科剪小心剝離膽囊。待膽囊完全剝離后,用1 ml的注射器從膽囊底部抽取膽汁,存放于EP管中,靜置6 h后,在4 ℃、1500 r/5 min的條件下迅速離心,用移液器吸取其上清液,于200 μl EP管分裝并做好標(biāo)記,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

紅外光譜的采集用無(wú)水乙醇清潔ATR附件的內(nèi)反射晶體表面后,滴加適量膽汁,吹干,測(cè)試樣品光譜。光譜范圍4000～400 cm-1,光譜分辨率4 cm-1,單張光譜累計(jì)掃描32次,以空氣作為光譜背景。數(shù)據(jù)處理,光譜縱坐標(biāo)由透過(guò)率轉(zhuǎn)變?yōu)槲舛?對(duì)光譜進(jìn)行ATR校正,接觸因子設(shè)為0,光譜基線自動(dòng)校正,光譜縱坐標(biāo)歸一化,使2000～800 cm-1區(qū)域內(nèi)最高吸光度為1、最低吸光度為0。

1.2.5 免疫組化染色：取樣本肝同一位置制作石蠟切片,厚度為5 μm,將石蠟切片脫蠟至水,0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),3%過(guò)氧化氫溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,加一抗鼠抗ABCA1(1∶200),4 ℃過(guò)夜。次日,PBS沖洗2次,每次3 min,小鼠二步法：檢測(cè)試劑盒孵育,加DAB顯色,經(jīng)復(fù)染,脫水,透明,封片,在超分辨顯微鏡下觀察,進(jìn)行圖像采集與分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間均值比較采用單因素ANOVA中的Dunnet-t檢驗(yàn);P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察 WT組小鼠一般情況較好,自主活動(dòng)性強(qiáng),背部毛發(fā)柔順光澤致密,緊貼皮膚;與WT小鼠相比,LD-3小鼠均出現(xiàn)常拱背、好聚堆、活動(dòng)度降低,毛發(fā)晦暗干枯,背部毛發(fā)及胡須出現(xiàn)不同程度的脫落,小便色黃、大便質(zhì)軟;LD-6、LD-9小鼠精神萎靡不振、嗜睡懶動(dòng)、好聚堆、常躲在籠子角落,皮毛稀疏油亮,小便顏色深黃,大便黏軟。此外,在LD-9小鼠的腹部皮下還發(fā)現(xiàn)了皮脂腺囊腫。

2.2 各組小鼠體重變化 利用高脂飼料,連續(xù)喂養(yǎng),分別觀察各組小鼠體重變化趨勢(shì),見(jiàn)圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著高脂飼料的喂養(yǎng),造模小鼠逐漸出現(xiàn)體重增加,與WT相比,LD-3就出現(xiàn)了體重的增加,LD-6、LD-9體重均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001,P<0.0001)。

2.3 各組小鼠血清中TC、TG含量 利用高脂飼料,連續(xù)喂養(yǎng),收集各組小鼠血清,觀察血清中TC、TG含量變化,見(jiàn)圖2。與WT相比,LD-3、LD-6、LD-9,血清TC水平均出現(xiàn)了顯著增高(P<0.05)(圖2A),血清TG水平均出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)(圖2B)。

注：△P<0.001,#P<0.01,*P<0.05

2.4 各組小鼠膽汁混濁度和膽囊脂質(zhì)沉積 動(dòng)物取材后,觀察膽囊內(nèi)容物的清亮程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),高脂飼料連續(xù)喂食后,LD-3時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)膽汁混濁現(xiàn)象,隨著時(shí)間的增加,膽汁混濁程度上升,其中LD-9尤為顯著,同時(shí),可以發(fā)現(xiàn)LD-9膽囊壁外附著大量脂肪(圖3A)。我們利用尼羅紅染色方法,在共聚焦顯微鏡下對(duì)膽囊壁進(jìn)行了觀察,結(jié)果顯示,與WT相比,造模組小鼠膽囊切片在LD-3、LD-6、LD-9可見(jiàn)大量脂質(zhì)沉積,且LD-9的脂質(zhì)沉積最為顯著(圖3B)。

A：肉眼觀察到的LD-3、LD-6、LD-9膽汁混濁現(xiàn)象;B：膽囊組織尼羅紅染色脂質(zhì)沉積

2.5 小鼠膽汁成分 進(jìn)一步,利用紅外光譜,對(duì)膽汁成分進(jìn)行了分析,紅外光譜分析結(jié)果顯示,WT中,2868 cm-1為膽固醇等甾類(lèi)化合物的C-H對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰(圖4黑色曲線)。利用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)9周,膽汁的紅外光譜發(fā)生明顯變化,相對(duì)于WT,LD-9中C-H對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰從2868 cm-1位移到2855 cm-1且強(qiáng)度增加,C-H彎曲振動(dòng)峰從1450 cm-1位移到1455 cm-1,同時(shí)在3074 cm-1處出現(xiàn)=C-H伸縮振動(dòng)峰(圖4紅色曲線),這些說(shuō)明LD-9的膽汁中CHOL含量明顯增加。另外,LD-9中蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶吸收峰分別從1638 cm-1和1544 cm-1位移至1629 cm-1和1551 cm-1,兩個(gè)譜帶的分離度也明顯降低,說(shuō)明LD-9膽汁中的蛋白質(zhì)與WT可能有所差別,而且LD-9膽汁中可能含有較多的脂肪酸類(lèi)成分。膽汁(吹干后)紅外光譜分析圖中,2868 cm-1為膽固醇等甾類(lèi)化合物C-H對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰,1638 cm-1和1544 cm-1為蛋白質(zhì)酰胺I帶與酰胺Ⅱ帶吸收峰。

圖4 WT和LD-9兩組小鼠膽汁成分

2.6 小鼠肝臟ABCA1蛋白表達(dá) 造模9周后,觀察WT和LD-9肝臟ABCA1蛋白表達(dá)。與WT相比,LD-9小鼠肝臟ABCA1蛋白表達(dá)水平明顯升高,見(jiàn)圖5。

圖5 WT和LD-9兩組小鼠肝臟ABCA1免疫組化結(jié)果(×200)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)判斷小鼠膽囊膽固醇沉著癥模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為：①膽囊黏膜膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)或排除障礙,造成膽囊黏膜膽固醇結(jié)晶沉積[9];②膽固醇的局部代謝紊亂,使膽汁膽固醇過(guò)飽和[10]。

本研究結(jié)果顯示,與WT組相比,在喂養(yǎng)期間,模型組小鼠體重顯著高于空白組,這表明在喂養(yǎng)了特殊飼料后,模型組小鼠較空白組小鼠體重增長(zhǎng)明顯,代謝水平在逐步下降,究其原因?yàn)楦咧暳献棠伒K脾,中焦積聚導(dǎo)致氣機(jī)郁滯,影響脾胃的升清降濁功能,體內(nèi)“痰濕”“瘀血”等病理產(chǎn)物阻滯。模型組小鼠出現(xiàn)皮毛脫落,考慮為濕熱蘊(yùn)結(jié),脂溢皮膚所致,類(lèi)似于脂溢性脫發(fā)的癥狀表現(xiàn)[11]。此外,在LD-9小鼠的腹部皮下還發(fā)現(xiàn)了皮脂腺囊腫,考慮是由于小鼠體內(nèi)氣滯痰凝,濕熱蘊(yùn)結(jié)所致[12]。諸多表現(xiàn)均符合中醫(yī)角度的肝膽濕熱狀態(tài)。與WT組相比,LD-3時(shí)膽汁出現(xiàn)混濁現(xiàn)象,隨時(shí)間增加,膽汁混濁程度上升,其中LD-9尤為顯著;進(jìn)一步利用紅外光譜,對(duì)膽汁成分進(jìn)行分析,結(jié)果LD-9的膽汁中TC含量增加。利用尼羅紅染色對(duì)膽囊組織進(jìn)行觀察結(jié)果顯示,造模組均可見(jiàn)脂質(zhì)沉積,且LD-9的最為顯著。結(jié)果表明高脂高膽固醇飲食和正常飲水9周的情況下可以導(dǎo)致膽囊膽固醇沉積。

膽汁膽固醇從外周組織經(jīng)過(guò)HDL-C途徑進(jìn)入肝臟被循環(huán)、代謝的過(guò)程稱(chēng)為膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)[13]。該過(guò)程有效避免了外周組織膽固醇的蓄積。ATP 結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要是ABCA1被認(rèn)為是介導(dǎo)肝臟膽固醇輸出的關(guān)鍵蛋白[14],參與介導(dǎo)磷脂和膽固醇向低脂或無(wú)脂A1(apo-A1)的轉(zhuǎn)移,以生成新生HDL顆粒[15]。特異性地在肝臟中上調(diào)ABCA1的表達(dá)能夠提高血漿內(nèi)HDL的含量。ABCA1表達(dá)不足會(huì)阻斷膽固醇和磷脂在肝細(xì)胞基底外側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn),致使因缺乏足夠的膽固醇和磷脂而影響 ApoA1蛋白脂化[16]。空載的ApoA1則被腎迅速清除出循環(huán)系統(tǒng),進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的HDL缺乏綜合征[17]。本研究中,造模組肝臟ABCA1表達(dá)增高,且LD-9顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明高脂高膽固醇飲食和正常飲水可增高肝臟ABCA1表達(dá),促進(jìn)膽囊膽固醇沉積。膽為中清之腑,隨著肝氣的疏泄而規(guī)律排泄。小鼠食用高膽固醇飼料(肥甘厚味)會(huì)導(dǎo)致濕熱之邪蘊(yùn)結(jié)腸胃,熏蒸肝膽,使少陽(yáng)升發(fā)之氣內(nèi)乏。氣郁而水濕、痰飲聚集,最終形成膽囊腔內(nèi)和膽囊壁的“積聚”癥狀。

脂質(zhì)代謝異常主要是指血清TC和TG水平過(guò)高和HDL-C水平過(guò)低[18]。目前脂質(zhì)代謝異常與膽囊膽固醇沉積的形成相關(guān)性仍存在爭(zhēng)議[19]。KHAIRY等[20]認(rèn)為膽固醇息肉患者血清TC水平升高,而B(niǎo)RAGHETTO等[21]和MENDEZ-SANCHEZ等[22]研究結(jié)果顯示,膽固醇息肉與血清TC水平無(wú)相關(guān)性。本研究中,造模組血清TC水平增高,TG水平降低,說(shuō)明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中血清TC、TG水平可作為造模的評(píng)價(jià)指標(biāo)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,肝臟具有疏泄作用,調(diào)節(jié)一身氣機(jī),當(dāng)肝氣郁結(jié)時(shí)會(huì)影響氣血暢通,導(dǎo)致血液瘀堵。高脂血癥與體內(nèi)病理產(chǎn)物堆積致血液黏稠狀態(tài)有關(guān),病理產(chǎn)物包括瘀血、痰濁、濕邪和食積等。肝氣郁結(jié)、血液、膽汁運(yùn)行不暢,故血脂增高、膽囊壁出現(xiàn)病理產(chǎn)物堆積。

肝和膽生理相關(guān),病理相連。肝屬足厥陰經(jīng),膽屬足少陽(yáng)經(jīng),二者互為表里,膽附著于肝。肝為厥陰乙木,屬將軍之官,喜條達(dá)而惡抑郁,喜升散而惡降斂;膽為少陽(yáng)甲木,屬奇恒之腑,以降為順,流暢為安,宜疏不宜滯,宜清不宜濁。肝膽相照,共主疏泄,肝司膽汁之分泌與排泄。《諸病源候論》中總述了膽石癥的發(fā)病原因：“氣水飲停滯結(jié)聚成癖”[23]。氣、痰飲、水濕積聚不散,聚于脅下,脅下滿痛,癥見(jiàn)黃疸。由此可見(jiàn),膽石癥主要由肝失疏泄,膽汁淤滯所致。將膽石癥分為五種證型：肝郁氣滯證、肝膽濕熱證、肝陰不足證、瘀血阻滯證和熱毒內(nèi)蘊(yùn)證[24]。章小燕等[25]對(duì)CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到的中醫(yī)藥治療膽固醇結(jié)石文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣滯型的頻數(shù)分布為35.81%,濕熱型為40.41%,陰虛型為3.07%,瘀血型為3.32%,熱結(jié)型為1.92%。可見(jiàn)肝郁氣滯證、肝膽濕熱證為膽石癥的主要證型。而本文建立的膽囊膽固醇沉著癥小鼠模型的臨床表現(xiàn),均符合肝郁氣滯、肝膽濕熱的證候特征。

綜上所述,本研究通過(guò)高脂高膽固醇飲食和正常飲水建立膽囊膽固醇沉著癥小鼠模型,并從疾病評(píng)價(jià)指標(biāo)和膽固醇代謝指標(biāo)兩個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估,所構(gòu)建模型特征符合臨床上膽囊膽固醇沉著癥的病理特征及常見(jiàn)中醫(yī)證候特征。