基于MAPK/ERK通路探討益腎調(diào)經(jīng)丸對大鼠多囊卵巢綜合征的作用和機(jī)制研究

劉雯星,陳 怡,黃 纓,殷秀琴,周 蕓

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430065;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬荊州中醫(yī)院,湖北 荊州 434000;3.荊州市中醫(yī)藥研究所,湖北 荊州 434000;4.荊州市中醫(yī)醫(yī)院,湖北 荊州 434000)

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是現(xiàn)代女性常見的生殖內(nèi)分泌疾病,以月經(jīng)周期紊亂、排卵障礙、卵巢多囊樣改變和高雄激素血癥(Hyperandrogenemia,HA)為主要特征[1]。其中,雄激素過高是導(dǎo)致卵泡生長停止甚至閉鎖等代謝異常狀況的主要原因[2]。目前,西醫(yī)治療主要為激素代替、調(diào)經(jīng)、促排卵[3],但存在不同程度的不良反應(yīng)。根據(jù)全國名中醫(yī)劉云鵬先生經(jīng)驗(yàn)方研制的醫(yī)院制劑益腎調(diào)經(jīng)丸,具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)血活血、調(diào)和沖任作用,可有效緩解PCOS患者臨床癥狀,改善卵巢功能,本研究通過觀察益腎調(diào)經(jīng)丸對PCOS大鼠激素水平和卵巢組織中絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MAPK/ERK)通路相關(guān)因子的影響,以期了解益腎調(diào)經(jīng)丸治療PCOS的作用機(jī)制,為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：雌性SD大鼠70只,6周齡,體重(180±20) g,購于湖北省疾控中心,動物生產(chǎn)合格證：SCXK(2022-0002)。大鼠分籠飼養(yǎng)于長江大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物房。本實(shí)驗(yàn)獲荊州市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),倫理批準(zhǔn)號：(荊中醫(yī))倫審研(2022032)號。

1.1.2 主要藥物：益腎調(diào)經(jīng)丸組方為,益母草15 g,丹參、菟絲子、枸杞子各20 g,熟地、茺蔚子各12 g,當(dāng)歸、川芎、白芍、香附、覆盆子、車前子各10 g,五味子、白術(shù)各9 g(制劑批號：鄂藥制備字 Z20200019),由荊州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。達(dá)英35(0.35 g/片),拜耳醫(yī)療保健有限公司(批號：J20210114)。以上藥物均以0.1% CMC-Na制成混懸液使用。

1.1.3 主要試劑：來曲唑(浙江海正藥業(yè)有限公司,批號：H20133109);瑞氏-姬姆薩染色液(常德比克曼生物科技有限公司,貨號：D010-1);睪酮(Testosterone,T)、促卵泡素(Follicle stimulating hormone,FSH)、促黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒(武漢CUSBIO生物科技有限公司,貨號分別為：CSB-E05100r、CSB-E06869r、CSB-E12654r);總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號：R1200),FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑,實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增試劑(北京天根生化科技有限公司,貨號分別為：KR118、FP205);HRP標(biāo)記山羊抗兔(碧云天生物,貨號：A0208),GAPDH抗體(廣州碩譜生物科技有限公司,貨號：BL006B);兔抗大鼠p-ERK1/2 抗體(美國Cell Signaling Technology,貨號：4370S)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器：顯微鏡(徠卡微系統(tǒng)公司,德國)、離心機(jī)(EPPendrof 公司,德國);多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);超聲組織破碎儀(NextAdvance公司,美國);石蠟切片機(jī)(俊杰電子有限公司,武漢);核酸檢測儀(Thermo Fisher Scientific,美國);多槽梯度PCR儀(ProFlex,APPlied Biosystems,美國);實(shí)時熒光定量PCR儀(LightCycler 96,羅氏公司,瑞士);SDS-PAGE電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、搖床(六一儀器廠,北京)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥：70只6周齡雌性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。隨機(jī)選取正常組10只,普通飼料+純凈水喂養(yǎng)。余60只作為造模組以來曲唑1 mg/(kg·d)灌胃+20%高脂飼料喂養(yǎng),連續(xù)干預(yù)30 d。造模第21天起,陰道涂片觀察大鼠陰道上皮細(xì)胞的改變,造模結(jié)束后隨機(jī)選取10只行血清雄激素及卵巢形態(tài)學(xué)分析加以驗(yàn)證,以其失去完整的動情周期、卵巢多囊樣改變、雄激素水平升高代表造模成功。

剩余50只模型大鼠再隨機(jī)分為空白對照組、達(dá)英35組和益腎調(diào)經(jīng)丸低、中、高劑量組各10只,灌胃藥物分別為0.9%氯化鈉溶液0.1 ml/kg、達(dá)英35 0.21 g/kg、益腎調(diào)經(jīng)丸0.9、1.8、3.6 g/kg,連續(xù)28 d。灌胃結(jié)束后停藥24 h,10%戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血,低溫離心后取血清。摘除兩側(cè)卵巢同時記錄重量,將卵巢組織一分為二,其中一部分卵巢在液氮中快速冷凍并在-80 ℃下保存以供進(jìn)一步分析,另一部分在4%多聚甲醛中固定保存。

1.2.2 蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察卵巢組織病理學(xué)變化：卵巢組織固定后,梯度酒精脫水、二甲苯透明,石蠟包埋;包埋后制作為4 μm厚的切片。制備好的石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min,無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min,90%酒精5 min,75%酒精5 min梯度脫蠟;蘇木素染色5 min;1%鹽酸酒精分化5 s;1%氨水返藍(lán)5 s,伊紅染色1 min;75%、90%酒精脫水各2 min,無水乙醇脫水5 min;二甲苯透明5 min,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 ELISA 檢測大鼠血清中性激素水平：根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作,測定各組大鼠血清中T、FSH、LH的含量,并計(jì)算LH/FSH。

1.2.4 Real-time PCR法檢測卵巢組織中17α-羥化酶(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)mRNA表達(dá)：用TRIzol試劑從卵巢組織中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,合成cDNA采用20 μl體積,反應(yīng)條件：為42 ℃,15 min;95 ℃,3 min;在20 μl反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以2 μl cDNA為模板,加入上下游引物,反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 32 s,共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,判斷PCR反應(yīng)特異性。以GAPDH為內(nèi)參,用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。PCR 引物序列見表 1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot法檢測卵巢組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)：各組卵巢組織在液氮中研磨,與RIPA裂解液振蕩混合,超聲裂解,BCA法定量分析蛋白濃度后金屬浴變性。制備SDS-PAGE凝膠,依次電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。TBST洗膜,一抗搖床孵育過夜(p-ERK1/2稀釋1∶2000;GAPDH 稀釋1∶1000)。再次TBST洗膜,加入二抗孵育2 h。孵育完成后再次TBST洗膜, ECL 發(fā)光液(A液∶B液=1∶1)顯影。

2 結(jié) 果

2.1 陰道涂片觀察大鼠動情周期變化 自造模第21天起觀察陰道涂片。造模組大鼠陰道涂片示細(xì)胞總數(shù)減少,多為白細(xì)胞,少許核上皮細(xì)胞和角化細(xì)胞散在,提示造模組大鼠失去完整的動情周期,始終處于動情間期,無排卵;正常組大鼠在動情期的陰道涂片見大量角化細(xì)胞,4～5 d出現(xiàn)一個完整的動情周期變化。見圖1。

圖1 大鼠陰道涂片(瑞氏-姬姆薩染色,×100)

2.2 各組大鼠卵巢肉眼觀察 正常組大鼠卵巢外觀淡紅、有光澤,表面可見結(jié)節(jié)狀卵泡;與正常組對比,模型組和空白對照組卵巢體積增加,外觀暗淡,可見囊性擴(kuò)張及諸多小卵泡;達(dá)英35組及益腎調(diào)經(jīng)丸各劑量組大鼠卵巢色澤恢復(fù),囊性擴(kuò)張減小或消失,可見數(shù)量不等的結(jié)節(jié)狀卵泡。見圖2。

A：正常組;B：益腎調(diào)經(jīng)丸低劑量組;C：益腎調(diào)經(jīng)丸中劑量組;D：益腎調(diào)經(jīng)丸高劑量組;E：達(dá)英35組;F：空白對照組;G：模型組

2.3 各組大鼠卵巢鏡下觀察 正常組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)完整,可見各級卵泡,發(fā)育良好,卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞層致密;模型組及空白對照組大鼠卵泡內(nèi)有明顯的囊性擴(kuò)張,顆粒細(xì)胞層明顯減少;達(dá)英35組及益腎調(diào)經(jīng)丸各劑量組大鼠卵巢組織內(nèi)含有各級卵泡,顆粒細(xì)胞層厚度增加,未見卵泡囊性改變。見圖3。

A：正常組;B：益腎調(diào)經(jīng)丸低劑量組;C：益腎調(diào)經(jīng)丸中劑量組;D：益腎調(diào)經(jīng)丸高劑量組;E：達(dá)英35組;F：空白對照組;G：模型組

2.4 各組大鼠血清中性激素水平比較 與正常組比較,模型組大鼠血清T、LH水平升高,LH/FSH升高,FSH水平降低(P<0.05),說明模型成功反映PCOS性激素水平紊亂的癥狀;與模型組比較,空白對照組無明顯變化(P>0.05),達(dá)英35組與益腎調(diào)經(jīng)丸各劑量組大鼠血清T、LH、LH/FSH均明顯降低,FSH明顯升高(P<0.05);達(dá)英35組與益腎調(diào)經(jīng)丸各劑量組之間血清T、FSH、LH水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表 2。

表2 各組大鼠血清T、FSH、LH水平、LH/FSH比較

2.5 各組大鼠卵巢組織中CYP17A1、CYP19A1 mRNA表達(dá)比較 與正常組比較,模型組大鼠卵巢組織中CYP17A1 mRNA表達(dá)升高,CYP19A1 mRNA表達(dá)下降(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠卵巢組織CYP17A1 mRNA表達(dá)下降,CYP19A1 mRNA 表達(dá)升高(P<0.05),空白對照組無明顯變化;達(dá)英35組與益腎調(diào)經(jīng)丸各劑量組大鼠卵巢組織CYP17A1和CYP19A1 mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠卵巢組織中 CYP17A1、CYP19A1 mRNA表達(dá)比較

2.6 各組大鼠卵巢組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)比較 與正常組比較,模型組大鼠卵巢組織中 p-ERK1/2的蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與模型組相比,益腎調(diào)經(jīng)丸各劑量組大鼠卵巢組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)下降(P<0.05),空白對照組及達(dá)英35組無明顯變化(P>0.05);益腎調(diào)經(jīng)丸各劑量組p-ERK1/2蛋白表達(dá)低于達(dá)英35組(P<0.05)。見表4(圖4)。

圖4 各組大鼠卵巢組織中 p-ERK1/2蛋白表達(dá)電泳圖

表4 各組大鼠卵巢組織中 p-ERK1/2蛋白表達(dá)比較

3 討 論

隨著生活方式的改變,PCOS發(fā)病率日益升高[4],大量研究表明,雄激素的異常合成和積累是發(fā)病的主要原因[5-6]。大量雄激素作用于卵巢導(dǎo)致排卵障礙、月經(jīng)稀發(fā),參與胰島素相關(guān)途徑導(dǎo)致肥胖和胰島素抵抗[7],作用于毛囊、皮下導(dǎo)致多毛、痤瘡[8],因而降低雄激素水平,能夠有效緩解諸多臨床癥狀。

有研究證實(shí)MAPK/ERK信號通路在PCOS的病理生理學(xué)中具有重要作用[9-11],MAPK/ERK信號通路的異常可使卵巢顆粒細(xì)胞增殖,導(dǎo)致異常卵泡生成和卵巢雄激素生成過多[12-13],CYP17A1、CYP19A1作為該通路的下游因子,直接參與調(diào)控激素合成與分泌[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)采用來曲唑結(jié)合高脂飼料[16]建立PCOS大鼠模型,與正常組對比,模型組大鼠出現(xiàn)一系列符合PCOS臨床表現(xiàn)和病理學(xué)變化的特點(diǎn),包括動情周期紊亂、卵巢多囊樣病變、T、LH水平升高、FSH水平降低等變化,提示造模成功。PCOS模型大鼠卵巢組織中p-ERK1/2蛋白及CYP17A1 mRNA表達(dá)升高,CYP19A1 mRNA表達(dá)下調(diào),卵巢局部維持高雄激素環(huán)境。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)益腎調(diào)經(jīng)丸可以降低 PCOS大鼠T和LH 水平,升高FSH水平,糾正LH/FSH,恢復(fù)PCOS大鼠規(guī)律動情周期;在卵巢病理變化方面,益腎調(diào)經(jīng)丸能夠恢復(fù)PCOS大鼠卵巢部分結(jié)構(gòu),增加各級卵泡數(shù)量,減少囊性卵泡數(shù)量并增加優(yōu)勢卵泡中顆粒細(xì)胞層數(shù),提示益腎調(diào)經(jīng)丸對PCOS大鼠具有治療作用,并且療效與達(dá)英35基本一致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示益腎調(diào)經(jīng)丸可以降低卵巢p-ERK1/2蛋白表達(dá),從而調(diào)整下游CYP17A1及CYP19A1 mRNA水平,減少雄激素異常合成和聚集。

益腎調(diào)經(jīng)丸是根據(jù)全國名老中醫(yī)劉云鵬老先生經(jīng)驗(yàn)方研制的醫(yī)院制劑,是劉老根據(jù)補(bǔ)腎活血理論擬定的治療月經(jīng)類疾病的經(jīng)驗(yàn)方。由五子衍宗丸與益母勝金丹加減而成,其中五子衍宗丸為經(jīng)典補(bǔ)腎方,既能補(bǔ)腎填精,又能收澀固精;益母勝金丹方中四物湯、丹參、茺蔚子、益母草養(yǎng)血活血調(diào)經(jīng),白術(shù)益氣健脾,香附疏肝理氣,諸藥合用,使得腎精充盛,氣血通暢[17-18]。方中多種藥物活性成分能夠調(diào)節(jié)性激素水平：菟絲子總黃酮具有類雌激素樣作用,能夠下調(diào)雄激素水平,糾正LH/FSH[19];枸杞多糖在降雄激素同時調(diào)節(jié)血糖、血脂[20-21];白芍總苷調(diào)節(jié)性激素水平同時改善腎臟損傷[22],其與當(dāng)歸共同的主要成分β-谷甾醇具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用[23];丹參、益母草、香附等藥物含木犀草素、槲皮素、山柰酚等活性物質(zhì)調(diào)節(jié)性激素水平,減輕炎癥反應(yīng)[24-25]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,益腎調(diào)經(jīng)丸可通過調(diào)節(jié)MAPK/ERK通路作用于PCOS模型大鼠,糾正血清性激素水平紊亂,改善卵巢多囊樣改變及恢復(fù)原有動情周期,其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。