PKCδ 與MALT1 對HIV-TB 共感患者細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用

李邦躍，李 黎，鐘雪梅，鄒小廣

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆 喀什 844000）

艾滋病（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是一種具有高傳染率、高死亡率的疾病，會導(dǎo)致人體失去免疫功能，目前尚無有效的疫苗和治療方法。結(jié)核病（tuberculosis，TB）是人類免疫缺陷病毒（HIV）/艾滋病（AIDS）患者最常見的機(jī)會性感染和死亡的主要原因之一[1]，約1/3 的HIV/AIDS 患者合并有結(jié)核菌感染，HIV/AIDS 患者感染結(jié)核菌后發(fā)展成為活動性結(jié)核病的概率是非艾滋病毒感染者的30 倍[2]。艾滋病與結(jié)核病雙重感染時，患者免疫功能缺陷加速病情惡化，死亡率極高，是臨床診療工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是全球公共衛(wèi)生的挑戰(zhàn)。近年研究發(fā)現(xiàn)[3]，HIV-TB 共感患者外周血IL-17、TNF-α、IL-23、IFN-γ 等促炎性因子表達(dá)異常，IL-10、IL-22 等抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平與單一感染患者有明顯差異。但有關(guān)于HIV-TB 共感患者體內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子異常表達(dá)的機(jī)制目前尚未十分清楚。國外研究發(fā)現(xiàn)[4]，PKCδ 是一種抑制HIV-1 整合的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），其抑制劑已被設(shè)計用于治療自身免疫性疾病，在初次感染期間聯(lián)合使用這些抑制劑和高效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，有助于避免大規(guī)模病毒感染和從受感染的CD4+T 細(xì)胞復(fù)制，在感染的早期階段減小儲存庫的大小。同時研究發(fā)現(xiàn)活動性肺結(jié)核患者全血中PKCδ 表達(dá)明顯上調(diào)，PKCδ 在結(jié)核肉芽腫的壞死區(qū)和空洞區(qū)高度豐富[5]。PKC可以通過CCR5 和gp120 之間的相互作用受到刺激[6]，這種激活有助于HIV-1 在其復(fù)制周期的不同步驟（包括進(jìn)入、整合和基因表達(dá)）進(jìn)行復(fù)制[7，8]。然而，PKCδ 在HIV-TB 共感染患者中的作用尚未見明確報道。而黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤異位基因1（mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1，MALT1）有助于穩(wěn)定狀態(tài)下的免疫耐受，同時促進(jìn)應(yīng)激條件下的免疫反應(yīng)[9]。研究表明[10]，在HIV 潛伏感染的ACH-2、Jurkat E4 和J-LAT 細(xì)胞中加入MALT1 抑制劑MI-2，可以在細(xì)胞刺激或蛋白激酶C 激動劑bryostatin 1 存在下加速細(xì)胞死亡，說明MI-2 和Bryostatin 1 的結(jié)合對HIV 潛伏感染的CD4+T 細(xì)胞具有選擇性殺傷作用。但是，MALT1 在HIV-TB 共感染患者疾病發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見報道。因此，本研究通過使用PKCδ 抑制劑和MALT1 抑制劑，觀察PKCδ 抑制劑和MALT1 抑制劑對HIV-TB 感染者細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響，探討HIV/TB 雙重感染中PKCδ 和MALT1 的作用，對進(jìn)一步闡明HIV/TB 雙重感染的發(fā)病機(jī)制以及防治具有十分重要的理論和實際應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021 年6 月-2022 年8 月喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院收治的4 例HIV-TB 共感患者。HIV-TB 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：既滿足TB 的診斷標(biāo)準(zhǔn)：滿足以下任何一條，痰查抗酸桿菌陽性2 次，痰查抗酸桿菌陽性1 次，同時結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性1 次，痰查抗酸桿菌陽性1 次，同時影像學(xué)支持肺結(jié)核；或痰培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，影像學(xué)支持肺結(jié)核；或影像學(xué)支持肺結(jié)核，同時結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性；或影像學(xué)支持肺結(jié)核，同時病理檢查支持肺結(jié)核，即可確診；又滿足HIV 的診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照艾滋病診療指南[11]，研究對象經(jīng)我院或外院艾滋病初篩陽性，后經(jīng)喀什地區(qū)預(yù)防控制中心艾滋病確認(rèn)實驗室確認(rèn)陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并所有可能影響Th17/Treg細(xì)胞的疾病，如肺炎、腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病、心血管疾病等。本研究已通過喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者入院時告知研究內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的分離與培養(yǎng) 所有納入實驗患者于住院次日清晨空腹無菌抽取5 ml 患者靜脈血并肝素鈉（500 IU/ml）2 ml 抗凝，用PBS 液將血液稀釋2～3 倍，充分混勻后將6 ml 抗凝靜脈血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4 ml 淋巴細(xì)胞分離液的10 ml 離心管中，水平離心機(jī)中水平離心（400 r/min，20 ℃）35 min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS 液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細(xì)吸管插到云霧層，吸取PBMC 置入另一50 ml離心管中，加入5 倍以上體積PBS，離心（300 r/min，20 ℃）10 min，棄上清；50 mlPBS 重懸細(xì)胞，離心（350 r/min，20 ℃）15 min，棄上清，加入Buffer（PBS+0.5%新生胎牛血清+2 mmol/LEDTA，pH7.2）2 ml，重懸細(xì)胞。

1.2.2 實驗分組 將分離的PBMC 常規(guī)培養(yǎng)后分為4組：空白對照組（不作任何處理）和B106 組[PKCδ抑制劑BJE6-106（B106）處理細(xì)胞]、MI-2 組（MALT1 抑制劑MI-2 處理細(xì)胞）、B106+MI-2 組（PKCδ 抑制劑B106 與MALT1 抑制劑MI-2 共同處理細(xì)胞）3 個試驗組，觀察PKCδ 抑制劑和MALT1 抑制劑對HIV-TB 感染者細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響。

1.2.3 檢測各組細(xì)胞水平及因子表達(dá)水平 ①流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17 細(xì)胞水平采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞水平（Human Th17 Staining Kit，人Th17 染色試劑盒，購自杭州聯(lián)科生物）。從樣本管和對照管中取100 μl 細(xì)胞懸液至新的流式管中，加入5 μl Anti-Human CD3，F(xiàn)ITC 和5 μl Anti-Human CD8α，PerCP-Cy5.5。震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。每管加入100 μl FIX &PERM Medium A，震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。每管加入2 ml 預(yù)冷1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 g 離心5 min，棄上清。每管加入100 μl FIX &PERM Medium B 和5 μl Anti-Human IL-17A，PE。震蕩混勻，室溫避光孵育15 min。每管加入2 ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 g 離心5 min，棄上清。每管加入500 μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重懸，上機(jī)檢測。②ELIAS 檢 測IL-2、IL-10、IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TNF-α 水平采用酶聯(lián)免疫吸附驗（ELISA）檢測各組IL-2、IL-10、IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TNF-α 水平[人白細(xì)胞介素2（IL-2）ELISA 試劑盒、人白細(xì)胞介素10（IL-10）ELISA 試劑盒、人白細(xì)胞介素17（IL-17）ELISA 試劑盒、人白細(xì)胞介素21（IL-21）ELISA 試劑盒、人白細(xì)胞介素23（IL-23）ELISA 試劑盒、人γ 干擾素（IFN-γ）試劑盒、人腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒，均采購自上海酶聯(lián)]。加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl 于反應(yīng)孔、加入待測樣品50 μl 于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50 μl 的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)此操作3 次。每孔加入80 μl 的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)此操作3 次。每孔加入底物A、B 各50 μl，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育10 min。避免光照。取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μl終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。在450 nm波長處測定各孔的OD 值。③qPCR 檢測MALT1、Iκbα、P65 以及IL-17、IL-23 的mRNA 表達(dá)實熒定量PCR 檢測各組中MALT1、Iκbα、P65 以及IL-17、IL-23 的mRNA 表達(dá)，各組中加入少量DMSO，作用48 h 后，提取各組總RNA，加入Trizol 試劑，加入氯仿，離心分離，加入異丙醇，離心，乙醇洗滌沉淀，離心分離白色RNA 沉淀，分光光度計檢測RNA 純度、濃度，特異性逆轉(zhuǎn)目的miRNA，合成相應(yīng)cDNA，熒光定量PCR 儀檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，納入研究對象一般臨床資料及病理特征，計量資料采用（±s）表示，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗，三組間采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P＜0.001 表示統(tǒng)計學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 Th17 細(xì)胞水平 與對照組相比，B106 組、MI-2組、B106+MI-2 組Th17 細(xì)胞水平明顯增高（P＜0.01），見圖1。

圖1 PKCδ 或MALT1 抑制劑對HIV-TB 患者外周血Th17 細(xì)胞水平的影響

2.2 炎癥因子水平 B106 或MI-2 單獨(dú)使用或兩者連用均可有效抑制HIV-TB 的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為IL-6、IL-17、IL-23、IFN-γ、TNF-α、IL-10 以及IL-22 的濃度均顯著下降（P＜0.001），但兩者聯(lián)用并無顯著效果（P＞0.05），見圖2。

圖2 PKCδ 或MALT1 抑制劑對HIV-TB 患者外周血炎癥因子水平的影響

2.3 mRNA 表達(dá) 抑制PKCδ 或抑制MALT1，以及兩者聯(lián)用均可顯著降低IL-17、IL-23 的mRNA 表達(dá)（P＜0.01）；抑制PKCδ 可顯著降低MALT1、P65 的mRNA 表達(dá)，并增加Iκbα 的mRNA 水平（P＜0.01），抑制MALT1 可顯著上調(diào)Iκbα 的mRNA 水平并降低P65 的mRNA 表達(dá)（P＜0.01）。同樣，兩者聯(lián)用與兩者單獨(dú)使用比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 PKCδ 或MALT1 抑制劑對HIV-TB 患者外周血中SYK、PKCδ、MALT1、Iκbα 以及P65 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

HIV/AIDS 患者合并TB 感染并非單純的合并感染，感染了HIV 的患者免疫系統(tǒng)缺損，所以大大增加了感染結(jié)核菌的風(fēng)險，而感染結(jié)核同時也會促進(jìn)HIV 的感染進(jìn)程[12]。HIV 侵入人體后主要導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞（特別是CD4+T 淋巴細(xì)胞）功能和數(shù)量減少，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能缺陷[13]，還會對體內(nèi)的炎性細(xì)胞因子（包括IFN-γ、TNF-α 等）的分泌產(chǎn)生影響。然而，這些細(xì)胞因子又會進(jìn)一步抑制身體的免疫能力。因此，在HIV/AIDS 患者中，TB 易于形成全身性播散，呈現(xiàn)出多器官彌散性的損傷[14]。

通常情況下，在細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB 處于失活狀態(tài)，它的二聚體形式的復(fù)合物能與一個抑制蛋白IkBα 結(jié)合成一個全新的三聚體復(fù)合物。在三聚體形式下，NF-κB 被IkBα 抑制而沒有活性。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的研究中，在RA 的早期、晚期炎癥關(guān)節(jié)的滑膜組織中均可檢測到NFκB 的活化，導(dǎo)致滑膜中浸潤大量的T 細(xì)胞，以CD4+T 細(xì)胞為主，激活的T 細(xì)胞可產(chǎn)生IL-2、IL-4、IFNγ 等細(xì)胞因子，參與RA 病變的持續(xù)進(jìn)展[15]。在微循環(huán)障礙中也會有NF-κB 的激活，通過調(diào)控IL-8、MCP 等趨化因子的表達(dá)，募集大量的單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，引發(fā)炎癥浸潤和微血管內(nèi)皮損傷。NF-κB 的激活還會促進(jìn)vWF 等因子的表達(dá)，影響凝溶的動態(tài)平衡，促進(jìn)微血栓的形成[16]。有研究顯示[17]，抑制PKCδ 可以影響HIV 的早期逆轉(zhuǎn)錄和限制后續(xù)的復(fù)制。在活動性TB 患者全血中的PKCδ 顯著上調(diào)[18]。

在本研究中，抑制PKCδ 或MALT1 可拮抗HIV-TB 患者的Th17 細(xì)胞數(shù)量下降，與Parihar SP等[18]的研究結(jié)果類似。本研究結(jié)果還顯示，單獨(dú)抑制或聯(lián)合抑制PKCδ 或MALT1 均可有效抑制HIV-TB 的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為IL-6、IL-17、IL-23、IFN-γ、TNF-α、IL-10 以及IL-22 的濃度均顯著下降，但兩者聯(lián)用并無顯著效果。而Parihar SP 等[18]在TB 動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制PKCδ 后在肺泡中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6 和IL-10 等表現(xiàn)出顯著增加。分析原因可能是兩試驗的研究對象不同，且Parihar SP 等[18]的研究未涉及HIV 感染，結(jié)果也可能會產(chǎn)生一定的差異。可見，抑制PKCδ 或MALT1 均可影響HIV-TB 共感患者免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。

但抑制PKCδ 或MALT1 影響NF-κB 信號通路中相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的研究甚少，本研究通過RT-qPCR 方法檢測抑制PKCδ 或MALT1 和聯(lián)合抑制后MALT1、Iκbα、P65 以 及IL-17、IL-23 的mRNA 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，抑制PKCδ 或MALT1 可通過抑制NF-κB 炎癥通路拮抗HIV-TB 的炎癥反應(yīng)。既往研究顯示[19]，在潛伏感染HIV-1 的細(xì)胞中，NF-κB通路的激活可以激活HIV-1 基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致HIV復(fù)制的爆炸性增加。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后，激活NF-κB 通路刺激炎癥因子的釋放，抵抗結(jié)核分枝桿菌的感染，藥物抑制NF-κB 蛋白后，則可以恢復(fù)結(jié)核分枝桿菌的感染[20]。

綜上所述，本研究證實了在HIV-TB 患者中，抑制PKCδ 或MALT1 均可影響HIV-TB 共感患者免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，并進(jìn)一步初步探明了抑制PKCδ 或MALT1 是通過NF-κB 通路發(fā)揮炎癥作用的。