基于糖酵解相關基因GFUS 對三陰性乳腺癌療效預測模型構建與驗證

章海斌，王 練

（蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤內科1，中醫科2，安徽 蚌埠 233000）

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一類特殊類型的乳腺癌，由于其缺乏雌激素和孕激素受體以及人表皮生長因子受體2（Her-2）的表達，表現出不同組織學類型，基因組和免疫特征，因而被單列為一類疾病[1]。流行病學資料顯示[2]，TNBC 的發生率占所有乳腺癌的15%～20%，好發于絕經前40 歲以下的年輕女性。TNBC 具有高侵襲的特性，術后復發率高，約25%，且術后復發時間僅為19～40 個月，遠低于非TNBC 患者的35～67 個月。遠處轉移發生率約46%，多累及腦及其他內臟器官，轉移后的中位生存時間為13.3 個月。因此其5 年死亡率遠高于其他類型乳腺癌，達40%。復發后TNBC患者發生3 個月內概率高達75%[3]。基于TNBC 的異質性與難治性，建立有效的預后生物標志物對TNBC 患者準確預后和合理治療策略至關重要。越來越多的證據表明，有氧糖酵解是癌細胞的重要代謝過程。不管是否有充足的氧氣，腫瘤細胞主要利用糖酵解來產生能量，并且具有較高的糖酵解率。這種有氧糖酵解表型被稱為Warburg 效應[4]。Warburg 效應已在不同類型的實體腫瘤中得到證實，包括乳腺癌[5]。因此，靶向糖酵解過程可能成為TNBC 的潛在治療靶點。GFUS 又稱組織特異性移植抗原P35B，是一種NADP(H)結合蛋白,催化GDP-D-甘露糖代謝中的兩步外聚酶和還原酶反應，將GDP-4-酮-6-D-脫氧甘露糖轉化為GDP-L-巖藻糖，在糖基化過程中起著關鍵作用[6]。GFUS 表達的增加可以同時誘導核心巖藻糖蛋白和巖藻糖蛋白的升高。這種異常的巖藻糖基化在結直腸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、食管癌等腫瘤中都普遍存在，其調控腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移、血管生成、轉移、免疫逃逸等方面發揮作用[7-9]。研究發現[10]，GFUS 的高表達在乳腺癌的發生發展中起重要作用，可作為乳腺癌的獨立分子標志物。因此，本研究通過應用多種生物信息學方法，實現GFUS 共表達基因鑒定，構建了TNBC 的預后模型，以期對指導TNBC 個體化治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 資料來源 從TCGA（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）獲取160 例TNBC 腫瘤樣本與113 例癌旁正常組織樣本的基因轉錄組數據及臨床數據。

1.2 方法

1.2.1 GFUS 在TNBC 中的表達差異及的功能分析使用R 軟件v4.0.3 進行統計分析，對GFUS 表達水平在癌與癌旁進行差異分析，P＜0.05 被認為差異有統計學意義。使用c2.cp.kegg.v2022.1.Hs.symbols.gmt集合，采用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）分析GFUS 高表達組和低表達組之間主要富集在的信號通路和表現的相應生物學功能。

1.2.2 差異基因的篩選及共表達基因鑒定 使用limma R 包對腫瘤和正常組織之間的DEG 進行鑒定（FDR＜0.05 and |log2FC|＞1），得到在TNBC 中差異表達的基因。通過皮爾森相關性分析選擇得到共表達基因（閾值相關性系數在0.4 及P＜0.05）。

1.2.3 基因篩選與模型構建 對差異共表達基因的表達量以及生存數據進行單變量Cox 比例風險回歸分析，利用R 包survival coxph function，選擇P＜0.05作為閾值得到預后顯著基因。通過Lasso 壓縮估計構建模型：使用R 軟件包glmnet 進行lasso cox 回歸分析，首先分析每個自變量的變化軌跡，隨著lambda 的逐漸增大而逐漸增加自變量系數趨于0 的個數，后使用5-fold 交叉驗證進行模型構建，分析每個lambda 下的置信區間，最終當lambda=0.042 357 2時模型達到最優，最終模型公式如下：

1.2.4 預后模型驗證 采用外部驗證來評估該模型的預測價值，外部驗證集和訓練集具有相同的模型和系數。同樣，每個樣本的風險得分由樣本的表達水平計算的而來。使用R 軟件包timeROC 對RiskScore進行預后分類的生存分析及受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析，分別分析3、5 年的預后預測分類效率。

1.3 統計學分析 R 軟件（R 版本：4.0.3）進行所有數據統計分析。Wilcoxon 檢驗用于連續變量分析，χ2檢驗用于分類數據分析。Kaplan-Meier 分析和Log-rank 檢驗用于生存差異計算。分析結果均以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基于TCGA 數據分析GFUS 在TNBC 中的表達差異 從TCGA 數據庫中獲得的mRNA 水平顯示，癌旁正常組織中的GFUS 水平低于癌組織（P＜0.05），見圖1。

2.2 GFUS 在TNBC 中的高表達與較差預后相關 與GFUS 低表達患者相比，GUFS 高表達患者具有更差的總生存率（overall survival，OS）（P＜0.05），見圖2A。同樣，高表達GFUS 的TNBC 患者具有更差的無進展生存期（progress free survival，PFS）、無病生存期（disease free survival，DFS）及疾病特異性生存期（disease free survival，DSS）（P＜0.05），見圖2B～圖2D。

圖2 GFUS 高低表達組生存指標差異

2.3 GFUS 高低表達組的功能分析 運用GSEA 分析GFUS 高表達組和低表達組的基因主要富集的信號通路和生物學功能見圖3A～3F。結果表明，高表達組主要富集在RENIN_ANGIOTENSIN_SYSTEM、GLUTATHIONE_METABOLISM、OXIDATIVE_PHOS PHORYLATION 等通路；低表達組主要富集在SMALL_CELL_LUNG_CANCER、WNT_SIGNALING_PATHWAY、TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY 等通路。

圖3 基因集富集分析（GSEA）結果

2.4 疾病差異表達基因鑒定 為了進一步探索三陰性乳腺癌中差異表達的基因，使用limma R 包對腫瘤和正常組織之間的DEG 進行鑒定（FDR＜0.05 and|log2FC|＞1），得到3050 個基因，其中在腫瘤組織中上調基因共有1099 個，下調基因有1951 個，差異表達基因的火山圖見圖4A，上下調前100 個基因的表達熱圖間圖4B。

圖4 差異表達火山圖和熱圖

2.5 GFUS 共表達基因鑒定 為了進一步鑒定GFUS共表達基因，通過皮爾森相關性分析選擇閾值相關性系數在0.4 及P＜0.05，共得到340 個共表達基因，其中正相關基因有308 個，負相關基因有32 個，相關性散點圖見5A，相關性基因的表達熱圖見5B。

2.6 模型構建 最終得到77 個差異共表達基因圖6A，對這77 個基因的表達量以及生存數據進行單變量Cox 比例風險回歸模型。利用R 包survival coxph function，選擇P＜0.05 作為閾值，最終得到了36 個預后顯著的基因。應用Lasso [Least absolute shrinkage and selection operator,Tibshirani（1996）]方法進行壓縮估計并構建模型，該算法可以進一步縮小基因范圍，同時保證較高準確率。使用R 軟件包glmnet 進行lasso cox 回歸分析，首先對每一個自變量的變化軌跡進行分析，自變量系數趨于0 的個數隨著lambda 的逐漸增大而增多，接著使用5-fold 交叉驗證構建模型，以分析每個lambda 下的置信區間。圖6B、圖6C 可以看出當lambda=0.042 357 2 時模型達到最優，最終模型公式如下：

圖6 篩選構建模型的相關基因

依據樣本的表達水平分別計算了每個樣本的風險得分，并繪制出樣本的RiskScore 分布。如圖7A所示，風險得分高的樣本OS 顯著低于得分較低的，這提示了高的RiskScore 樣本預后更差。4 個不同的signature 基因隨著風險值的增加表達情況發生變化，鑒定了GPLD1 的高表達和低風險相關，為保護因素；鑒定了GFUS、ATP6V0B、MFSD3 的高表達和高風險相關，為危險因素。根據RiskScore 中值將樣本劃分高低風險組，并繪制KM 曲線，如圖7B 所示，從中可以看出兩組差異及其顯著Log-rankp=0.004 59，HR=3.476（95%CI：1.469～8.229），其中80個樣本被劃分為高風險組，80 個樣本為低風險組；進一步使用R 軟件包timeROC 對CubScore 進行預后分類的ROC 分析，分別分析了1、3、5 年的預后預測分類效率，如圖7C 所示，從中可以看出模型具有很高的AUC 線下面積，在0.687 以上。

圖7 預測風險模型的構建

2.7 外部數據驗證 采用和訓練集相同的模型和系數來實現外部驗證，以評估該模型的預測價值。外部驗證集中采用與訓練集相同的模型和相同的系數。根據樣本的表達水平來依次計算樣本的風險得分，使用R 軟件包timeROC 對RiskScore 進行預后分類的ROC 分析，對3、5 年的預后預測分類效率進行了分別分析，如圖8C 所示，從中可以看出該模型具有很高的AUC 曲線下面積，5 年的在0.68 以上，接下來對Riskscore 進行劃分高低分線，并繪制KM 曲線，從中可以看出他們存在極顯著的差異Log -rankp=0.0446，HR=2.137（95%CI：1.018～4.483），其中高風險組的樣本數為45 個，低風險組的樣本數為62 個，見圖8A、圖8B。

圖8 外部數據集驗證風險模型

3 討論

三陰性乳腺癌是一種具有侵襲性的乳腺癌亞型，因缺少特異靶向藥物，化療仍是當前的主要治療手段[11]。隨著精準醫學的發展，現已進入腫瘤管理的新時代。發現新的標志物對于提高TNBC 的診療效果有著重大意義。

癌細胞經歷了新陳代謝的改變，以滿足對能量、構建模塊和氧化還原電位的巨大需求。腫瘤即使在有氧氣的情況下也會表現出分泌葡萄糖和乳酸的行為，這一過程被稱為有氧糖酵解[12]。糖酵解是癌細胞代謝的支柱，而癌細胞已經進化出各種機制來加強它。葡萄糖代謝與其他代謝途徑交織在一起，使癌癥代謝變得多樣化和異質化，其中糖酵解發揮著核心作用[13]。致癌信號傳導加速了糖酵解酶的代謝活動，主要是通過增強其表達或翻譯后修飾。有氧糖酵解將葡萄糖發酵成乳酸，通過各種機制支持腫瘤的生長和轉移[14]。最新研究也證實[15]，糖酵解與腫瘤治療耐藥相關。已知糖酵解中間產物的積累可激活磷酸戊糖途徑產生NADPH。NADPH 的產生使癌細胞能夠維持足夠水平的還原性谷胱甘肽（GSH）。GSH 是一種關鍵的非酶抗氧化劑，通過維持氧化還原狀態以抵消化療藥物的作用，在保護癌細胞免受抗腫瘤藥物的侵害方面發揮著關鍵作用[16]。同時，對糖酵解依賴性的增加是腫瘤代謝重編程的重要特征，這一過程參與了腫瘤微環境與腫瘤免疫調節[17]。因此，靶向糖酵解過程不僅可以抑制腫瘤生長、遷移和侵襲，同時，有望通過抑制糖酵解來提高抗腫瘤免疫治療效果。

與其他亞型相比，三陰性乳腺癌更加依賴糖酵解過程[18]。缺氧時HIF-1α 水平升高也與有氧糖酵解增加有關，與非TNBC 細胞相比，HIF-1α 穩定在TNBC 細胞中更常見。然而，HIF-1α 的穩定并不局限于缺氧條件，在有氧條件下也能穩定，這足以驅動常氧條件下的糖酵解。有研究發現[19]，50%在常氧條件下表現出HIF-1α 穩定的癌細胞系是高度糖酵解和高侵襲性的。在常氧條件下HIF-1α 穩定背后的機制來自于乳酸和丙酮酸（有氧糖酵解的最終產物）通過刺激HIF-1α 的積累來調節缺氧誘導的基因表達，即使是在缺氧獨立的條件下。Sadeghalvad M[20]等證實與ER+腫瘤相比，TNBC 中的丙酮酸和乳酸顯著增加；TNBC 與ER+腫瘤相比，幾乎所有糖酵解中間體都上調，這表明TNBC 糖酵解過程增加。

GFUS 作為參與糖酵解過程的關鍵基因，在多種腫瘤中高表達。本研究結果顯示：GFUS 在TNBC中的表達顯著高于正常組織，且這種高表達與不良預后密切相關。基因富集分析結果顯示：高GFUS表達組多參與腫瘤代謝過程。基于對GFUS 共表達基因篩選發現，GPLD1 的高表達和低風險相關，為保護因素；鑒定了GFUS、ATP6V0B、MFSD3 的高表達和高風險相關，為危險因素。將篩選出的基因構建模型，根據該模型將TNBC 患者分為高低風險組。生存分析顯示出高風險組OS 顯著低于低風險組，提示GFUS、ATP6V0B、MFSD3 與TNBC 患者預后密切相關。風險評分可作為獨立預后因素。另外，該模型可以有效預測不同風險組中乳腺癌患者3、5年生存率。本研究尚有一定局限性，數據均來自TCGA 數據庫，在其他數據庫和臨床樣本中的驗證需進一步進行。

綜上所述，基于GFUS 構建的預后模型可以很高的評估TNBC 患者預后，并可為TNBC 靶向治療藥物發展及增強免疫治療效果提供新思路。