液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定小龍蝦中硝基呋喃類代謝物殘留量的不確定度評定＊

吳祥慶，楊姝麗，吳明媛，黃鸞玉，謝宗升，蒙源，龐燕飛

（廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530021）

0 引言

測量不確定度是指表征合理地賦予被測量之值的分散性與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)［1］。《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定能力評價檢驗檢測機構(gòu)通用要求》（RB/T 214—2017）中要求檢驗檢測機構(gòu)應(yīng)建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，給出相應(yīng)檢測能力評定測量不確定度的案例［2］。

硝基呋喃類藥物是一類廣譜抗生素，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖［3］。硝基呋喃類藥物具有遺傳毒性，有可能導(dǎo)致基因變異，我國已于2002年頒布禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。硝基呋喃類藥物原型藥在動物體內(nèi)雖代謝迅速，但代謝物會與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的殘留物。一般判定動物源性食品中硝基呋喃類藥物的殘留狀況都是以其硝基呋喃類代謝產(chǎn)物的含量作為檢測依據(jù)，硝基呋喃類藥物主要有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林，其對應(yīng)的代謝物分別為3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、5-甲基-嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）和氨基脲（SEM）。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確，成為目前硝基呋喃類代謝物主要的檢測方法。陳茹等［4］、呂燕［5］、蒙麗瓊等［6］、林功師［7］、郭麗娜等［8］、李緒鵬等［9］、邢麗紅等［10］都對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定硝基呋喃類代謝物的不確定度進行評定，但在對內(nèi)標(biāo)物引入的不確定度的分量上，未充分考慮內(nèi)標(biāo)法的特點，即內(nèi)標(biāo)物引入不確定度來自內(nèi)標(biāo)添加量的重復(fù)性。本文根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）對《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31656.13—2021）測定小龍蝦中硝基呋喃代謝物殘留量的不確定度進行評定，分析不確定度的主要來源，保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Xevo TQ-XS 型號，配有電噴霧ESI離子源，美國Waters公司生產(chǎn)）；電子天平（梅特勒-托利多XS205DU、常熟市雙杰測試儀器廠生產(chǎn)的JJ200型號）；振蕩培養(yǎng)箱（LRH-250-Z型號，韶關(guān)市宏泰醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)）；多管式旋渦混合器（美國Troemner 公司Talboys 子公司生產(chǎn)）；氮吹儀（TurboVap LV 型號，拜泰齊貿(mào)易上海有限公司生產(chǎn)）；冷凍離心機（Centrifuge 5804R 型號，德國艾本德公司生產(chǎn)）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q Gradient 型號，美國密理博公司生產(chǎn)）；單道移液器（德國BRAND 公司生產(chǎn)）。

1.2 試劑與材料

標(biāo)準(zhǔn)品AOZ、AMOZ、SEM·HCl 和AHD·HCl（Dr.Ehrenstorfer，純度≥98%）；內(nèi)標(biāo)物AOZ-D4、AMOZD5、AHD-13C3、SEM·HCl-13C15N2（Dr.Ehrenstorfer，純度≥98%）；鹽酸（優(yōu)級純）、2-硝基苯甲醛（色譜純）、二甲亞砜（色譜純）、氫氧化鈉（分析純）、磷酸氫二鉀（分析純）、乙酸乙酯（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙酸銨（優(yōu)級純）、甲酸（色譜純）；實驗用水為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)貯備液：稱取AOZ 10.0 mg±0.1 mg、AMOZ 10.0 mg±0.1 mg、AHD·HCl 13.2 mg±0.1 mg、SEM·HCl 14.9 mg±0.1 mg，分別用甲醇溶解并定容至100 mL 容量瓶中，濃度為100 mg/L。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取4 種標(biāo)準(zhǔn)貯備液各0.1 mL至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，濃度為0.1 μg/mL。

（3）內(nèi)標(biāo)貯備液：稱取AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM·HCl-13C15N2各1 mg，分別用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，濃度為100 mg/L。

（4）混合內(nèi)標(biāo)工作液：移取4 種內(nèi)標(biāo)物貯備液各0.01 mL 到100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，濃度為0.01 μg/mL。

（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線：移取標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL 于空離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)工作溶液0.5 mL，除不加樣品外，其余步驟按樣品前處理操作，曲線濃度為1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L，待測。目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，以硝基呋喃類代謝物的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品前處理

稱取樣品2 g（精確到0.01 g）于50 mL 離心管中，加入0.5 mL 混合內(nèi)標(biāo)工作液和5 mL 鹽酸溶液（0.3 mol/L），如果樣品結(jié)塊不易分散，可用玻璃棒將樣品搗碎，加入150 μL 2-硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），37 ℃避光振蕩16 h，使樣品分散。

取出樣品，避光冷卻至室溫。加入4～5 mL磷酸氫二鉀-氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH 值至7.2 左右（用精密pH 試紙測試）。加入8 mL 乙酸乙酯，振蕩10 min，4 000 r/min 離心5 min，取上清液至10 mL 的玻璃離心管中，40 ℃氮氣吹干。加入1 mL 甲醇溶液（5%），漩渦混勻30 s。如果溶液混濁，可14 000 r/min 離心10 min。用一次性注射器將下層清液小心吸出，經(jīng)0.2 μm 微孔濾膜過濾，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定用。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：C18 柱（100×2.1 mm，粒徑1.9 μm）或其他性能相當(dāng)?shù)纳V柱；柱溫：30 ℃；進樣托盤溫度：10 ℃；進樣量：10 μL；流動相：甲醇，5 mmol/L 乙酸銨（含0.1%甲酸），流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件表

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：ESI 源，正離子模式；毛細管電壓：3.00 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/Hr；碰撞氣流量：0.15 mL/min；霧化氣流量：7.00 Bar；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（MRM）（具體參數(shù)見表2）。

表2 選擇反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的數(shù)學(xué)模型

硝基呋喃類代謝物含量的計算公式為

其中：x為試樣中硝基呋喃類代謝物的含量（μg/kg）；y為響應(yīng)值（目標(biāo)物面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值）；a為斜率；b為截距；m為樣品質(zhì)量（g）；V為樣品定容體積（mL）。

2.2 不確定度的來源及計算結(jié)果

從測量過程和數(shù)學(xué)模型分析可知，測定硝基呋喃類代謝物的不確定度主要來自以下4 個方面：①校正過程的不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度、稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中量器移取和定容產(chǎn)生的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中容量誤差和重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度、采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得試樣濃度過程中引入的不確定度；②樣品質(zhì)量的不確定度；③內(nèi)標(biāo)物加入量的不確定度；④樣品前處理操作過程差異的不確定度。

2.2.1 校正過程的不確定度

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)證書給出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、擴展不確定度和包含因子，計算標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度（結(jié)果見表3）。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

2.2.1.2 稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的不確定度

表4 稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的不確定度

2.2.1.3 量器移取和定容產(chǎn)生的不確定度

表5 量器移取和定容產(chǎn)生的不確定度

2.2.1.4 容量誤差和重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度

表6 曲線各級別的合成相對標(biāo)準(zhǔn)的不確定度

2.2.1.5 曲線最小二乘法擬合引入的不確定度

以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值yi為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，AOZ、AMOZ、AHD、SEM 擬合曲線分別為yAOZ=0.171 74x+0.013 99、yAHD=0.130 06x+0.015 15、yAMDZ=0.265 92x+0.069 03、ySEM=0.336 16x-0.107 77。計算理論值y?=ax+b，曲線擬合理論值計算結(jié)果見表7。

表7 曲線擬合理論值計算

表8 曲線擬合引入的不確定度

2.2.2 樣品質(zhì)量引入的不確定度

2.2.3 內(nèi)標(biāo)物引入的不確定度

硝基呋喃類代謝物檢測采用內(nèi)標(biāo)法定量，樣品與曲線在加入等量內(nèi)標(biāo)物前處理，因此內(nèi)標(biāo)物純度對結(jié)果無影響，不確定度來自添加內(nèi)標(biāo)物的重復(fù)性誤差，即移取內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液的移液器的重復(fù)性。

2.2.4 樣品前處理過程引入的不確定度

樣品前處理步驟操作會產(chǎn)生不確定度，以7次添加水平為2.5 μg/kg 的加標(biāo)回收率計算不確定度（結(jié)果見表9）。

表9 樣品前處理過程引入的不確定度

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成以上計算所得的不確定度，結(jié)果見表10。

表10 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4 檢測結(jié)果

在95%置信區(qū)間內(nèi)，測量結(jié)果的擴展不確定度包含因子k=2，U=k×urel×。最終檢測結(jié)果表示為cAOZ=2.29 μg/kg，U=0.33，k=2；cAMOZ=2.41 μg/kg，U=0.27，k=2；cAHD=2.45 μg/kg，U=0.31，k=2；cSEM=2.37 μg/kg，U=0.27，k=2。

3 結(jié)論

本文實驗采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法》測定小龍蝦中硝基呋喃代謝物殘留量的不確定度，分析不確定度的來源，通過建立相應(yīng)數(shù)學(xué)模型，對測定結(jié)果的測量不確定度進行評估。結(jié)果表明曲線的配制、擬合過程是不確定度的最大來源。因此，實際操作過程中可以通過增加標(biāo)準(zhǔn)曲線測定次數(shù)、選擇精度較高的玻璃量器和移液器及引入不確定度較小的稀釋方式來降低不確定度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。