葛花菊花水煎液中總黃酮含量的測定方法研究

權春梅,李金富,馬省委,曹帥,修慧迪,李媛媚,李揚,汪蘭蘭

(1.亳州職業技術學院 藥學院,安徽 亳州 236800;2.安徽萬花草生物技術公司,安徽 亳州 236800;3.亳州學院 中藥學院,安徽 亳州 236800;4.安徽中醫藥大學 藥學院,安徽 合肥 230000)

葛花是豆科植物野葛(PuerariaLobata(Willd.)Ohwi)或甘葛藤(Pueraria.thom-soiiBeeth.)的未開放的干燥花。《神農本草經》等記載葛花是傳統的中藥解酒藥物,具有解酒醒脾的功效,主要治療酒后引起的嘔逆吐酸、發熱煩渴、吐血、 腸風下血等癥狀。常用于傷酒煩熱口渴、頭痛頭暈、嘔吐吞酸、脘腹脹滿、不思飲食、吐血,腸風下血等癥狀[1]。從古至今葛花被廣泛地應用于解酒領域,在解酒方面可謂是有著獨領風騷的地位。在《圣濟總錄》中記載葛花散:葛花一兩。上一味,搗為散,沸湯點一大錢匕,不拘時候,亦可煎服[2],來治飲酒中毒。《別錄》也有:“主消酒[3]。”近些年科研工作者對葛花的研究越來越多,發現葛花在解酒方面具有很高的藥用價值,葛花所含的化學成分較多,目前發現的主要有黃酮類、皂苷類、揮發油類、甾醇類、生物堿和氨基酸等,其中黃酮類化合物的含量相對最高[4]。葛花含有豐富的皂角苷、異黃酮能有效地抑制腸胃對酒精的吸收,促進血液中酒精代謝和排泄[5]。此外,葛花中的鳶尾素可以抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性,并且能恢復谷胱甘肽巰基轉移酶和谷胱甘肽的活性,起到保護肝臟的作用[6]。

菊花為菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)的干燥頭狀花序,性味甘、苦,微寒;歸肺、肝經,具有散風清熱、平肝明目、清熱解毒;常用于頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒等[7]癥狀。其化學成分較復雜,最主要的有效成分為黃酮類、揮發油和三萜類化合物;具抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老耐疲勞、肝保護等作用[8-10]。

明代醫家杜文夑撰在《藥鑒》記載醫方“(菊花)…解醉漢昏迷,易醒,共干葛(宜葛花)煎湯。”此方是將葛花和菊花在一起用水煎法制備葛花菊花水煎液,口服,來治療醉酒。而在葛花和菊花中,黃酮類物質是兩者共有的成分,也是解酒的關鍵成分,因此,研究葛花菊花水煎液中總黃酮的含量對于研究該方的解酒機理和功效具有重要的意義。

目前適用于葛花總黃酮的含量測定方法有:分光光度法[11]、高效液相色譜法[12]、薄層色譜法[13]、毛細管電泳法[14]。分光光度法又包括可見分光光度法和紫外分光光度法。該法無需特別復雜的儀器設備,操作快捷方便,應用廣泛。本文主要是利用分光光度法對葛花菊花水煎液中總黃酮含量的測定方法進行研究,通過對比測量葛花水煎液中總黃酮濃度的不同方法,選擇適宜的測量葛花菊花水煎液中總黃酮濃度的方法。該研究為利用古方開發葛花菊花解酒功能飲料打下了基礎。

1 試驗器材與試劑

1.1 材料和試劑

葛花(購自亳州康美中藥材市場),經亳州職業技術學院程翔老師鑒別為野葛的花;亳菊花采收于安徽省亳州市譙城區小李村,經亳州職業技術學院程翔老師鑒定為亳菊的花,并將其陰干儲存備用。蘆丁標準品:江蘇永健醫藥科技有限公司( 批號: 200226-210404z);鳶尾苷標準品:江蘇永健醫藥科技有限公司(批號:200153-160806);無水乙醇(國藥集團有限公司); 純凈水(合肥娃哈哈飲料有限公司)。其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

全自動煎藥鍋(廣東萌圈科技有限公司);UV-5900PC型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);天平(上海菁海儀器有限公司,FA21048);AE224C型電子計重計數天平(上海舜宇恒平科學儀器科技有限公司);移液器。

2 實驗方法

2.1 可見分光光度法(顯色法)測定

2.1.1 樣品溶液的制備

稱取葛花和菊花各10 g,置于全自動煎藥鍋中,加水700 mL浸泡30 min,設置煎煮時間為42 min,水煎后得到葛花菊花水煎液,過濾,即制得樣品原溶液。由于樣品原溶液的顏色較深,因此,需要稀釋。準確取樣品原溶液1.00 mL置于100 mL容量瓶中,加純化水稀釋至刻度,即得樣品溶液。

2.1.2 蘆丁對照品溶液的制備

稱取15.3 mg蘆丁對照品置100 mL容量瓶,用70%乙醇溶解至刻度處,即得0.153 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 顯色溶液的配制及顯色

10%硝酸鋁:精密稱量5 g的Al(NO3)3,在小燒杯中用純化水溶解,移至50 mL容量瓶中定容至刻度線處。

5%亞硝酸鈉:量取2.5 g的NaNO2,在小燒杯中用純化水溶解,移至50 mL容量瓶定容至刻度線處。

4%氫氧化鈉:量取2 g的NaOH,在小燒杯中用純化水溶解,至50 mL容量瓶定容至刻度線處。

樣品溶液和對照品溶液的顯色:準確量取樣品溶液和對照品溶液各1 mL,按NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法,在10 mL容量瓶中依次添加顯色劑,然后在可見光范圍內分別對樣品溶液和對照品溶液進行光譜掃描。

2.2 紫外分光光度法

2.2.1 以蘆丁為對照品的紫外分光光度法測定

蘆丁對照品溶液的制備:準確取“2.1.2”中的蘆丁對照品溶液1.00 mL置10 mL容量瓶,用70%乙醇溶液定容至刻度。

樣品溶液的制備:同“2.1.1”樣品溶液的制備。

將蘆丁對照品溶液和樣品溶液在紫外光范圍內進行光譜掃描。

2.2.2 以鳶尾苷為對照品的紫外分光光度法

鳶尾苷對照品溶液的制備:取鳶尾苷對照品2.0 mg用50%乙醇制成每1 mL含0.04 mg的溶液,得鳶尾苷對照品溶液。

樣品溶液的制備:同“2.1.1”樣品溶液的制備。

將樣品溶液和鳶尾苷對照品溶液在紫外光范圍內進行光譜掃描。

3 結果與分析

3.1 可見分光光度法(顯色法)試驗結果

通過對比蘆丁對照品溶液和樣品溶液顯色后在可見光區波長范圍內的吸收曲線的特征(見圖1),來確定以蘆丁對照品的顯色法是否合適測定樣品溶液中總黃酮的含量。結果表明蘆丁對照品顯色后在506 nm處有吸收峰位,而樣品溶液在可見光范圍內無吸收峰位。由此判斷該可見分光光度法中不適用于測定樣品溶液中總黃酮的含量。

圖1 蘆丁與樣品顯色后的溶液吸收光譜圖

3.2 紫外分光光度法試驗結果

3.2.1 以蘆丁為對照品的試驗結果

通過對比圖2中蘆丁對照品溶液與樣品溶液在紫外光的波長范圍內是否具有共同的峰位,確定蘆丁對照品的紫外分光光度法是否適用于測定葛花菊花水煎液中的總黃酮。結果表明蘆丁對照品溶液在258 nm處有最大峰值,而樣品溶液在264 nm處有最大吸收峰值。兩者的吸收峰位相差6 nm。因此,如果以蘆丁對照品的紫外分光光度法來測定葛花菊花水煎液中的總黃酮,可能會因為兩者吸收峰位的差距造成測定誤差的增大。

圖2 蘆丁對照品溶液、鳶尾苷對照品額與樣品溶液的吸收光譜圖

3.2.2 以鳶尾苷為對照品的試驗結果

通過對比圖2中鳶尾苷對照品溶液與樣品溶液在紫外-可見光區范圍內的光譜吸收,得知鳶尾苷對照品溶液和樣品溶液在波長264 nm有吸收峰,兩者吸收峰位一致。表明了以鳶尾苷對照品的紫外分光光度法最適用于葛花菊花水煎液中的總黃酮含量的測定(見圖2)。

3.3 方法學考察

3.3.1 入射光波長的確定

通過圖2得知鳶尾苷對照品溶液和樣品溶液均在波長264 nm有吸收峰,因此,把264 nm作為入射光的波長。

3.3.2 精密度試驗

用“2.1.1”樣品溶液,以純化水作參比溶液,在最大波長264 nm處連測6次樣品溶液的吸光度,并記錄每次測量結果,計算標準偏差(RSD)。試驗結果如表1,經過精密度實驗,RSD為0.11%(<5%)。表明用該方法測定葛花水煎液具有良好的精密度,符合含量分析的要求。

表1 精密度試驗結果(n=6)

3.3.3 穩定性試驗

取“2.2.2”項下的鳶尾苷對照品溶液和“2.1.1”樣品溶液,在最大波長264 nm處每隔10 min分別各測定一次吸光度,共測6次,并將測量的吸光度值記錄下來,以此計算標準偏差(RSD),具體數據見表2。經比較發現鳶尾苷對照品溶液與葛花菊花水煎液的相對標準偏差均為0.05 (<5% ) ,本實驗說明該對照品溶液與葛花菊花水煎液在60 min內的穩定性良好。

表2 穩定性試驗結果(n=6)

3.3.4 重復性試驗

取“2.1.1”下樣品溶液,在最大波長264 nm處該樣品溶液的吸光度值。并記錄每次測量結果,計算標準偏差(RSD)。實驗結果如表3。經實驗測試,發現這種方法的準確度為0.11% ,表明其重復性較好。

表3 重復性試驗結果(n=6)

4 結論

通過對比以上三種方法,結果表明NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色的可見分光光度法不適用葛花菊花水煎液中總黃酮的含量測定;紫外分光光度法中蘆丁對照品與樣品溶液吸收峰位存在一定的差距,也不是特別適合用來測定葛花菊花水煎液中總黃酮的含量。而鳶尾苷標準品與樣品溶液的吸收峰基本一致,通過精密度、穩定性、重復性試驗證明該法符合方法學考察的要求,由此確定以鳶尾苷作為對照品的紫外分光光度法比較適合測定葛花菊花水煎液中總黃酮的含量。