基于網絡藥理學和分子對接技術探討高良姜治療痛風和高尿酸血癥的作用機制

任騰騰,于瀟飛,李云*,劉業志,張同妍,郭中原

(1.山東中醫藥大學 藥學院,山東 濟南 250355;2.山東省立第三醫院 藥學部,山東 濟南 250031;3.中國中醫科學院 中藥研究所,北京 100700;4.河南中醫藥大學 藥學院,河南 鄭州 450000)

當前,隨著社會的發展,人民生活水平逐漸提高,痛風和高尿酸血癥已成為臨床常見病,高尿酸血癥臨床表現為血清尿酸(UA)含量升高(男性UA ≥ 420 μmol/L,女性UA ≥ 360 μmol/L)。當血清 UA 水平高于正常閾值時,尿酸單鈉(MSU)晶體沉積在關節上,引起關節損傷和炎癥反應,最終使人患上痛風[1-2]。近年來,痛風和高尿酸血癥的發病率和患病率逐年增加[3]。全球痛風患病率在 0.1% 到 10% 之間[4];2016 年統計顯示中國痛風發病率為 5.61%,并呈逐年上升趨勢[5]。具有易診難治,復發率較高的特點,嚴重降低患者的生活質量。因此,降低血清UA含量是預防和治療痛風、高尿酸血癥的主要措施[6]。目前,臨床上對于痛風和高尿酸血癥主要有物理治療、藥物治療以及手術治療等,但因發病機制復雜,均無法根治。臨床上常用的藥物如別嘌醇、苯溴馬隆等均存在不同程度的不良反應[7-9]。因此,尋找和開發活性優良的降低血清UA藥物迫在眉睫。近年來科學研究已經證實,高良姜中的黃酮類成分能顯著降低高尿酸血癥小鼠的血清UA水平[10-11]。高良姜我國的傳統中藥材,具有溫胃止嘔,散寒止痛的功效。黃酮類、揮發油和二苯基庚烷等是其主要化學成分[12-13]。藥理研究發現,高良姜具有抗氧化、抗胃潰瘍、抗炎等作用[14-15]。在民間,高良姜被廣泛用作食材、湯料、調味品以及香料等,對其進行降尿酸產品開發可帶來較好的經濟和社會效益。然而,高良姜治療痛風和高尿酸血癥的機制尚不清楚,尤其是其有效化學成分的分子靶點機制,因此,有必要對高良姜治療痛風和高尿酸血癥的具體靶點和通路等進一步探索。

本研究首先運用網絡藥理學,建立了“成分-疾病-靶點-通路”網絡關系圖,再通過蛋白質-蛋白質交互作用和靶點富集分析,最后篩選出活性成分,分析高良姜治療痛風和高尿酸血癥的分子機制,并利用分子對接驗證活性成分與蛋白的親和力,為高良姜治療痛風和高尿酸血癥的作用機制研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 高良姜化學成分及其作用靶點的收集

藥物化學成分及靶標數據來源于TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[16],以“高良姜”為關鍵詞檢索化學成分,對高良姜的有效成分進行篩選,其中設定口服生物利用度(OB)≥ 30%,類藥性(DL)≥ 0.18。從TCMSP中獲取相篩選成分的靶點,并利用Uniprot數據庫進行靶點名稱規范。基于Pubchem數據庫[17]獲得上述化合物的SDF結構。

1.2 高尿酸血癥和痛風疾病作用靶點的收集

以“hyperuricemia”、“gout”為關鍵詞使用OMIM數據庫,Disgenet數據庫,Genecards數據庫進行檢索,得到高尿酸血癥和痛風疾病作用靶點。

1.3 高良姜-高尿酸血癥和痛風共同靶點的篩選

運用Venny2.1在線作圖工具,導入高良姜篩選成分作用靶點、痛風及高尿酸血癥相關靶點,繪制韋恩圖,兩者取交集后獲得高良姜藥物-痛風及高尿酸血癥共同靶點,即為高良姜治療痛風及高尿酸血癥的潛在作用靶點。

1.4 網絡構建及分析

運用Cytoscape 3.7.2軟件將“高良姜-化學成分-作用靶點-高尿酸血癥和痛風疾病”網絡圖可視化,通過Network Analyzer對網絡圖進行藥物、成分、靶標、通路之間的拓撲計算分析,Degree值代表了化學成分與作用靶點之間的相關個數,而Degree數值由大到小表代表化學成分關鍵程度由大到小,從而獲得核心成分。

1.5 PPI網絡構建及核心靶點分析

將高良姜與疾病的共同靶點導入STRING數據庫,確定蛋白種類為“Homo sapiens”,設置最低相互作用閾值參數0.4,再獲取PPI網絡關系數據后,將數據導入Cytoscape軟件,繪制PPI網絡圖,其中,Degree值的高低根據節點的大小、顏色及其深淺變化不同表示。基于拓撲分析篩選核心靶點,將PPI網絡導入Cystoscap 3.7.2中,使用NetworkAnalyzer工具進行拓撲解析,以degree,betweenness centrality,average shortest path length 和closeness centrality四種參數為參考標準,選擇degree分值超過平均分的基因為核心靶點,使用R 3.6.1工具繪制靶點條形圖。

1.6 GO和KEGG富集分析及可視化

為了說明中藥化合物對應的預測靶點在基因功能和通路中的作用,運用R軟件Bioconductor生物信息軟件進行關鍵靶基因的GO和KEGG富集分析(P<0.05,Q<0.05),輸出可視化條形圖及氣泡圖。

1.7 分子對接驗證

LibDock 是 Discovery Studio 中的一種對接方法[8]。 通過這種計算機輔助虛擬活性篩選的方法,可以在不進行實驗的情況下的篩選出小分子的活性,經過多年的發展,該方法準確性高,操作簡便,可進行小分子高通量活性篩選,是目前藥物研究領域較為重要的一種技術。在 PPI 網絡的核心靶標中,選擇前 5 個靶標進行分子對接虛擬活性驗證。在Discovery Studio 19.0(Chuang Teng Technology Co.,Ltd.,Beijing,China)中,使用Libdock算法評估化合物與痛風和高尿酸血癥靶點之間的潛在分子結合模式。結合位點分別基于共結晶配體與 5 個靶標的結合來定義。在對接篩選實驗之前,去除靶標蛋白共結晶配體,并使用相同的參數將制備的配體與蛋白質對接。根據對接結果,選擇具有最低對接能量的最佳得分對接模型代表化合物的最佳配體結合位點。對于每個配體,計算相互作用能量以定義配體和受體之間的相互作用,并分析預測的結合相互作用。

2 結果與分析

2.1 對高良姜的化學成分的篩選

在TCMSP數據庫中設定OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18,對高良姜的有效成分進行篩選,共得到潛在活性成分13個(表1),TCMSP數據庫篩選出180個活性成分作用靶點。

表1 高良姜的潛在活性成分

表1(續)

表1(續)

2.2 疾病作用靶點篩選

以“hyperuricemia”、“gout”為關鍵詞,分別在OMIM、Disgenet、Genecards 數據庫進行檢索,去重后分別獲得1 101個痛風作用靶點,802個靶點高尿酸血癥作用靶點,二者取交集后獲得319個兩疾病的共同靶點(如圖1)。

圖1 高尿酸血癥和痛風共同靶點

2.3 高良姜藥物-痛風及高尿酸血癥疾病共同靶點的篩選

采用Venny2.1在線作圖工具,導入180個高良姜藥物靶點、1 101個痛風作用靶點,802個高尿酸血癥作用靶點,繪制韋恩圖,三者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點28個(如圖2)。

圖2 高良姜與痛風、高尿酸血癥靶點韋恩圖

2.4 網絡構建及分析

采用Cytoscape軟件導入高良姜中13個潛在活性成分和28個藥物-疾病共同靶點,繪制“高良姜-化學成分-作用靶點-高尿酸血癥和痛風疾病”網絡圖(如圖3)。高良姜中的11種活性成分(刪除其中2個與疾病靶點無交集的成分)根據degree降序排列分別為 quercetin,kaempferol,isorhamnetin,galangin,beta-sitosterol,1,7-diphenyl-5-hydroxy-3-heptanone,7-Methoxy-8-(2'-ethoxy-3'-hydroxy-3'-methybutyl)coumarin,medicarpin,(2S,3R)-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5,7-dimethoxychroman-3-ol,5-methoxy-1,7-diphenyl-3-heptanone,butyl-2-ethylhexyl phthalate。

注: 圖中紫色代表高良姜,綠色三角形代表高良姜中的11種活性成分,藍色橢圓形代表28個藥物-疾病共同靶點,紅色菱形代表疾病。

2.5 PPI網絡構建及核心靶點分析

2.5.1 構建蛋白交互作用網絡圖

為了更直觀地表征高良姜治療痛風及高尿酸血癥的作用機制,采用STRING 數據庫分析高良姜與兩疾病的28個交集靶點基因的交互作用,按“1.5”PPI網絡構建方法將所得數據導入 Cytoscape 3.7.2軟件中,制作PPI網絡(如圖4)。經軟件計算可知,網絡中共含有28個節點,210條邊,平均節點數15。

圖4 高良姜與痛風及高尿酸血癥交集基因蛋白相互作用網絡

2.5.2 基于拓撲分析的核心靶點篩選

將PPI網絡導入Cystoscap 3.7.2中,通過“1.5”中基于拓撲分析的核心靶點篩選的方法以NetworkAnalyzer工具實現拓撲分析,采用R 3.6.1制作前 30 位靶點的條形圖(如圖5)。基于 PPI 拓撲分析排名前5位的核心靶標在蛋白質相互作用網絡中較為關鍵,包括 CCL2、CXCL8、IL1B、VEGFA、ICAM1。

2.6 KEGG 和GO富集分析

2.6.1 GO富集分析

將28個共同靶點經R語言運行后得到GO 條目1 256條,結果顯示,交集基因集合共富集至1205條生物學過程(Biological process,BP)通路;交集基因集合共富集至10條細胞組分表達(Cellular component,CC)過程;交集基因集合共富集至41個與分子功能(Molecular function,MF)相關的過程。從 BP 的富集結果來講,高良姜治療痛風及高尿酸血癥的靶標主要參與調節對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、細胞對生物刺激的反應、對營養水平的反應、細胞對脂多糖的反應、對腫瘤壞死因子的反應、細胞對細菌來源分子的反應、衰老、白細胞細胞-細胞黏附、細胞對外界刺激的反應等(圖6(a))。從 CC 的富集結果來說,靶標主要涉及質膜筏、膜微結構域、RNA聚合酶II轉錄因子復合物、膜區、轉錄因子復合物、核轉錄因子復合物、質膜外側、血小板α顆粒腔等(圖6(b))。從 MF 的富集結果來講,靶標主要參與調節細胞因子受體結合、磷酸酶結合、細胞因子活性、受體配體活性、蛋白磷酸酶2A結合、蛋白酶結合、蛋白磷酸酶結合、RNA聚合酶II轉錄因子結合、BH結構域結合、死亡結構域結合等(圖6(c))。

圖5 排名前30的核心靶點

圖6 高良姜治療痛風及高尿酸血癥的GO富集分析條形圖

2.6.2 KEGG富集分析

高良姜治療痛風及高尿酸血癥的28個共同靶點導入R語言分析后得到118條KEGG通路,前20位KEGG通路條形圖(如圖7),其中P-value代表富集顯著性,所有通路都是有意義(P-value<0.05)且顏色越紅則說明顯著性越高。主要信號通路涉及:糖尿病并發癥中的AGE-RAGE、液體剪切應力和動脈粥樣硬化、TNF、IL-17、NF-κB、類風濕關節炎、Nod樣受體、Toll樣受體等信號通路,這提示高良姜可能是通過調控多個通路發揮治療痛風及高尿酸血癥作用。

圖7 高良姜治療痛風、高尿酸血癥的KEGG富集分析

2.7 分子對接結果

LibDock 是 Discovery Studio 中的一個對接應用程序,將具有不同結合親和力的配體分子對接以生成熱圖,以指示配體與其結合位點之間的相互作用,并優化獲得的能量 (Ayoub et al.,2018)。最后,保留得分較高的對接構象。使用這種篩選方法,可以縮小PPIs的范圍,并且可以進一步篩選潛在的生物活性配體。從PBD數據庫(http://www.rcsb.org/pdb/)中檢索到 前5 個靶標的晶體結構(PDB ID分別為CCL2:4zk9,CXCL8:6n2u,IL1B:6y8m,VEGFA:1vpf,ICAM1:1iam),去除蛋白質中的水分子并純化蛋白質。從 PubChem 數據庫 (https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得前5 個化合物高良姜素(galangin)、異鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)的3D分子結構。采用治療痛風和高尿酸血癥的藥物別嘌醇(allopurinol)作陽性對照配體。

結果發現,高良姜素、異鼠李素、β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素分別與CCL2、CXCL8、IL1B、VEGFA有較好的結合,LibDock對接得分均高于陽性藥別嘌醇,而與ICAM1未結合(表2)。5種化合物中異鼠李素分別與4種蛋白獲得了最高的LibDock對接得分(如圖 8)。異鼠李素與CCL2(PBD ID:4ZK9)結合的LibDock分數為 78.2015(如圖 8(a)),其結合作用通過異鼠李素B環與SER B:63、THR B:45氨基酸殘基形成碳氫鍵;C環與SER B:63、LEU B:25、ILE B:20氨基酸殘基形成π-Sigma相互作用;C環與SER B:21、ARG B:24氨基酸殘基形成amide-π堆疊相互作用;A、B、C環與VAL B:22、LEU B:25、ILF B:20、ILF B:51氨基酸殘基形成π-alkyl相互作用。異鼠李素與CXCL8(PBD ID:6N2U)結合的LibDock分數為85.6050(如圖 8(b)),其結合作用通過異鼠李素A、B環羥基與LEU A:3、VAL A:25氨基酸殘基形成常規氫鍵;A環與ARG A:24、LYS A:1形成碳氫鍵;A、B、C環與ILE A:26形成π-alkyl相互作用。異鼠李素與IL1B (PBD ID: 6Y8M) 結合的LibDock分數為85.8516(如圖 8(c)),其結合作用通過異鼠李素C環羰基與ASN A:108形成常規氫鍵;B環甲氧基與LYS A:103、ASP A:54形成碳氫鍵;A環與IEU A:110 形成π-alkyl相互作用。異鼠李素與VEGFA結合的LibDock分數(PBD ID:1VPF)為78.2015(如圖 8(d)),其結合作用通過異鼠李素C環羥基與CYS B:61形成常規氫鍵;B、C環與ASP B:63、GLU B:64、GLU B:64、CYS B:61形成碳氫鍵;A、C環與CYS B:60形成π-alkyl相互作用。

注:圖中用三字母氨基酸代碼及其位置注釋殘基, 疏水殘基呈綠色,而極性殘基呈紫色,水分子呈青色,受體和配體之間的相互作用用不同顏色的虛線表示,與相應的殘基顏色一致。

表2 高良姜中5個化合物與4個靶標LibDock分子對接得分

3 總結與討論

痛風是一種慢性疾病,由于血清尿酸水平過高導致尿酸晶體沉積在關節并引起炎癥,表現為關節紅、腫、熱、痛,常見于指尖、肘、跖趾、跟腱等部位;2016 年統計顯示中國痛風發病率為5.61%,并呈逐年上升趨勢[5]。目前,對于痛風和高尿酸血癥還沒有根治的方法。西醫是主要的治療方法,但長期使用藥物會產生副作用。本研究基于網絡藥理學技術分析,探討高良姜治療痛風和高尿酸血癥的活性成分及作用機制。結果從TCMSP數據庫中獲得了11種潛在活性化合物,前5位關鍵成分為槲皮素、山柰酚、異鼠李素、高良姜素、β-谷甾醇;篩選出高良姜藥物-痛風及高尿酸血癥疾病28個共同靶點,通過PPI網絡構建及核心靶點分析前4位關鍵靶點是CCL2、CXCL8、IL1B、VEGFA;關鍵通路包括糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、液體剪切應力和動脈粥樣硬化、TNF信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路、類風濕關節炎等信號通路;此外,高良姜還通過調節20個生物過程、10個細胞組分表達過程和20個分子功能來防治痛風和高尿酸血癥。這也說明高良姜由多種化合物組成,通過多途徑作用于痛風和高尿酸血癥的不同靶點,為后期臨床用藥和作用機制研究提供依據。

基于KEGG富集分析的結果,本文選擇了與痛風和高尿酸血癥治療相關的糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路進行如下分析:

糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路。高級糖基化終末產物(AGEs)是還原糖與脂質、蛋白質和核酸結合的非酶合成的產物。AGEs與其受體產生的晚期糖基化終末產物(RAGE)結合能誘導各種類型的細胞和器官的氧化應激和炎癥[19-20]。圖9為AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的分析結果。研究表明,AGEs聯合RAGE可顯著提高OA軟骨細胞中TGF-β和MMP-9 mRNA、IL-1、蛋白的表達水平,顯著降低過氧化氫酶和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,增加丙二醛水平,顯著促進NF-κB 的核轉位[21]。TGF-β和MMPs的表達水平可作為實驗觀察指標,以判斷OA的嚴重程度。實驗研究證明,槲皮素能夠抑制絲裂原活化蛋白激酶 (MAPKs) 的磷酸化、核因子 κ-B 激酶 (IKK)α/β等與炎癥過程相關的信號通路,激活轉錄因子 2 (ATF2) 和核因子 (NF)-κB p65,并阻止 NF-κB p65 易位進入細胞核。通過降低IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、sICAM-1 和 MCP-1 產生阻斷 MAPK 和 NF-κB 信號通路的激活進而改善炎癥反應[22]。異鼠李素可劑量依賴性的降低NF-κB信號通路中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和TGF-β1的蛋白和mRNA的表達[23]。綜上所述,糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路可能是高良姜治療痛風性關節炎的關鍵通路。

圖9 糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路圖

IL-17信號通路。在急性痛風性關節炎的早期階段會出現局部炎癥加強,伴隨著關節紅腫和劇烈疼痛[24]。其中,IL-17是一種主要的促炎因子[25]。由IL-17信號通路圖(如圖10)可知,IL-17通過激活相關受體,介導NF-κB通路的激活;而TNF-α、IL-1β等炎性細胞因子也能增強IL-17的活性,增強基質金屬蛋白酶(MMP1/3/9/13)的表達[25]。文獻研究證實,IL-17與其受體結合,可激活NF-κB和MAPK等下游通路,誘導IL-6、TNF-α等表達,繼而誘發炎癥反應[26]。在痛風性關節炎患者中也存在這一過程,由于NF-κB和激活蛋白1(AP-1)通路被激活[27],可增加促炎細胞因子IL-1β、IL-8、IL-17、TNF-α和NLRP3的表達[28]。實驗研究證明,高良姜素及高良姜醇提物[29]、異鼠李素[30]能有效降低大鼠血清中的 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎癥因子的水平,槲皮素[30]、山奈酚[31]、谷甾醇[32]可降低TNF-α水平,表明高良姜可能通過抑制IL-17信號通路來治療痛風和高尿酸血癥。

圖10 IL-17信號通路圖

TNF信號通路。TNF-α是一種促炎細胞因子,能誘導炎癥因子 IL-1β的表達,兩者之間具有相互刺激的作用, IL-1β可以提高TNF-α的活性[34]。通過分析TNF信號通路圖(如圖11)可知,NF-κB通路被激活,增加了應激活化蛋白激酶(JNK1/2)和細胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化水平,進而促進促炎細胞因子IL-1β和IL-6的表達,來誘導炎癥反應的發生。實驗研究證實,TNF-α可誘導類風濕關節炎(RA)分泌脂多糖,促進成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖,促進其表達炎癥因子如IL-1β和IL-6,并增加細胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化水平[35]。TNF-α在尿酸鈉(MSU)晶體誘導的小鼠痛風性關節中顯著升高,并與關節炎的嚴重程度呈正相關[36]。而高良姜素及高良姜醇提物[29]、異鼠李素[30]能有效降低大鼠血清中的 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎癥因子的水平,山奈酚[31]可通過抑制LPS誘導的IL-6、IL-1β和COX-2分泌發揮抗炎作用,槲皮素[32]、谷甾醇[33]可降低TNF-α的表達水平,表明高良姜可能通過抑制TNF-α信號通路來治療痛風和高尿酸血癥。

圖11 TNF信號通路圖

目前,高良姜總黃酮及單體化合物高良姜素、異鼠李素、β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素降尿酸藥理活性研究報道較多,說明活性顯著,但是臨床應用或相關產品開發較少。本研究通過網絡藥理學方法,闡述了高良姜防治痛風和高尿酸血癥的復雜網絡關系,其作用特點是多成分調控多靶點,繼而調控多通路的炎癥反應。通過分析高良姜降尿酸的活性成分和分子機制,為進一步開展高良姜降尿酸作用機制研究和降尿酸產品開發提供了科學依據。本研究所獲得的關鍵活性成分和作用靶點是基于網絡藥理學數據庫的信息,分子對接虛擬篩選技術驗證了成分與靶點的親和作用,但仍需動物實驗進一步驗證,因此后續將在此基礎上開展相關實驗進一步證實高良姜治療痛風及高尿酸血癥的作用機制。