達(dá)立通顆粒運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)功能性消化不良作用機(jī)制的探討

陶琳,趙晗宇,劉朝青,張芳

(1.南昌弘益藥業(yè)有限公司,江西 南昌 330096;2.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004)

功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是指伴有上腹痛、脹,噯氣,食欲不振等臨床癥狀的一種臨床常見(jiàn)功能性胃腸病,可分為運(yùn)動(dòng)障礙型、潰瘍型及非特異型[1]。全世界FD的患病率較高,西方國(guó)家約10%～40%,亞洲國(guó)家約5%～30%[2]。而FD發(fā)病機(jī)制并未明確。西醫(yī)多認(rèn)為FD與腸胃動(dòng)力障礙、內(nèi)臟敏感過(guò)度、社會(huì)心理因素、十二指腸黏膜病癥、幽門螺旋桿菌感染等有關(guān)[3]。

在FD的治療上,中醫(yī)認(rèn)為宜在通利消滯和胃降逆的基礎(chǔ)上,佐以清熱解郁之劑。達(dá)立通顆粒處方則是根據(jù)古人“腑氣以通為用”的原則研制而來(lái),處方是由柴胡、枳實(shí)、木香、陳皮、清半夏、焦山楂、焦檳榔、雞矢藤、黨參、延胡索、六神曲、蒲公英組成,方中12味中藥材都具有調(diào)節(jié)胃腸功能、促進(jìn)消化之功效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來(lái)興起的一門具有“多基因、多靶點(diǎn)”特點(diǎn)的藥理學(xué)分支學(xué)科,展示了疾病與相關(guān)靶點(diǎn)的復(fù)雜關(guān)系,為疾病發(fā)病機(jī)制與治療提供新思路,是中藥學(xué)科研究的前沿和焦點(diǎn)。本文對(duì)達(dá)立通顆粒進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,探究達(dá)立通顆粒對(duì)FD得作用機(jī)制。

1 資料與方法

將達(dá)立通顆粒中12味中藥名稱輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合文獻(xiàn)檢索,搜集12味中藥材的活性化學(xué)成分,篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%,成藥相似性(DL)≥0.18,將活性化學(xué)成分2D結(jié)構(gòu)輸入Swiss Institute of Bioinformatics數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)一步篩選。將搜集到的活性化學(xué)成分通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Institute of Bioinformatics數(shù)據(jù)庫(kù)中的SwissTargetPrediction進(jìn)行潛在靶點(diǎn)的搜集。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“活性化學(xué)成分靶點(diǎn)”互相作用網(wǎng)絡(luò)圖。采用DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)、GENECARDS數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù),在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集與FD相關(guān)的靶點(diǎn)基因,整理后建立FD相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。剔除重復(fù)靶點(diǎn)后,經(jīng)過(guò)Venn分析,得到達(dá)立通顆粒潛在作用FD靶點(diǎn)基因,構(gòu)建“中藥-化學(xué)成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。用數(shù)據(jù)庫(kù)String檢索潛在作用FD的靶點(diǎn)基因,得到蛋白之間的互相作用信息,通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。將疾病-藥物成分共同靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行GO功能富集分析,選擇生物過(guò)程(biological process,BP)/細(xì)胞組(cell component,CC)/分子功能(molecμLar function,MF)排名前十的通路,繪制條形圖;進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析,設(shè)置P<0.05,剔除廣泛通路后,得到排名靠前的重要通路繪制氣泡圖。通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)和ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)分別搜集度值(degree)排名靠前的蛋白質(zhì)和小分子配體,AutoDockTools1.5.6進(jìn)行分子對(duì)接(若結(jié)合能<0,表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合),并將打分結(jié)果通過(guò)GraphPad Prism8生成熱圖,將打分最高的結(jié)果通過(guò)PyMol2.5生成分子對(duì)接圖。

2 結(jié)果

2.1 主要活性化學(xué)成分的篩選與搜集

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道,經(jīng)OB、DL條件按篩選共得到活性化學(xué)成分71個(gè)(圖1)。

圖1 達(dá)立通顆粒活性化學(xué)成分網(wǎng)絡(luò)

2.2 活性化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)的搜集

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到活性化學(xué)成分去重后對(duì)應(yīng)的903個(gè)作用靶點(diǎn)。通過(guò)軟件Cytoscape3.7.2將候選活性成分和靶點(diǎn)相連,該網(wǎng)絡(luò)由984個(gè)節(jié)點(diǎn),6 771條邊(圖2)。

圖2 達(dá)立通顆粒“活性化學(xué)成分靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 FD疾病靶點(diǎn)的搜集及與達(dá)立通顆粒作用靶點(diǎn)Venn分析

通過(guò)DRUGBANK等數(shù)據(jù)庫(kù)建立FD相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集,剔重之后,共搜集到592個(gè)FD疾病相關(guān)靶點(diǎn)。經(jīng)過(guò)Venn分析活性成分對(duì)應(yīng)的903個(gè)作用靶點(diǎn)與592個(gè)FD疾病相關(guān)靶點(diǎn),得到達(dá)立通顆粒潛在作用FD的133個(gè)靶點(diǎn)基因。進(jìn)而運(yùn)用Cytoscape3.7.2軟件得“中藥-化學(xué)成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。

圖3 “中藥-化學(xué)成分-靶基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 生物分子網(wǎng)絡(luò)建立

通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)檢索133個(gè)Venn分析得到得靶點(diǎn),利用軟件Cytoscape對(duì)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。其中degree排名前5的靶點(diǎn)為PIK3CA、AKT1、STAT3、MAPK1、SRC,可認(rèn)為是達(dá)立通顆粒治療FD的核心靶點(diǎn)(圖4)。

圖4 靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系圖

2.5 富集分析

將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能、KEGG通路分析,GO功能分析的BP/CC/MF各有133個(gè)生物過(guò)程,選取各排名前十的通路做條形圖。其中BP富集結(jié)果有RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、細(xì)胞增殖正調(diào)控等。CC富集結(jié)果有質(zhì)膜、細(xì)胞核等。MF富集結(jié)果有蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合等。

KEGG信號(hào)通路富集分析得到125條通路,選取排名靠前的20條富集較大通路做圖(圖5)。富集結(jié)果所涉及通路有PI3K/AKT信號(hào)通路、Rap 1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Jak-STAT通路等。

圖5 EGG信號(hào)通路富集分析

2.6 分子對(duì)接結(jié)果分析

選取五個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與五個(gè)活性有效成分進(jìn)行分子對(duì)接,繪制熱圖(圖6)。由圖可知:MAPK1和山柰酚(kaempferol)結(jié)合力最高,打分為-3.38,其次是SRC和橙皮素(Hesperetin)為-2.94。并給予結(jié)合能力最高的MAPK1與山柰酚繪制分子對(duì)接圖(圖7)。

圖6 分子對(duì)接打分熱圖

圖7 MAPK1和山柰酚分子對(duì)接圖

3 討論與小結(jié)

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道,篩選后得到達(dá)立通顆粒活性化學(xué)成分71個(gè)。在133個(gè)與FD有關(guān)的潛在靶基因中,黃酮類活性成分作用靶點(diǎn)占絕大部分,如山柰酚、橙皮素、槲皮素等。黃酮類化合物在自然界分布廣泛,且對(duì)于功能性消化不良患者治療效果顯著[4]。

從PPI圖可知degree排名前5的靶點(diǎn)分別為PIK3CA、AKT1、STAT3、MAPK1、SRC。在KEGG通路富集中,所涉及通路有PI3K/AKT通路、Rap 1通路、MAPK通路、Jak-STAT通路等。

PIK3CA作用于PI3K-AKT通路。AKT1為AKT類型之一,是PI3K-AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)的重要一環(huán)[5]。響應(yīng)細(xì)胞外信號(hào),PI3K-ATK通路通過(guò)磷酸化調(diào)控其下游通路eNOS,產(chǎn)生NO。在FD發(fā)病機(jī)制中NO和其代謝物的影響極為重要,作用于胃腸道平滑肌,導(dǎo)致胃腸道蠕動(dòng)減少[6]。AKT的表達(dá)可激活NF-κB(核因子κB),加強(qiáng)釋放炎癥因子,引起胃黏膜損傷[7]。

STAT3經(jīng)刺激后可作用于Jak/STAT通路調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)。十二指腸、抑郁與FD發(fā)病有關(guān),FD患者伴隨十二指腸的低度炎癥且更易產(chǎn)生抑郁傾向[8-9]。分布廣泛的Jak/STAT信號(hào)通路是參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的重要部分,有實(shí)驗(yàn)表明,調(diào)節(jié)此通路,可降低炎癥因子水平,促進(jìn)腸黏膜修復(fù)減輕損傷[10],可降低中樞炎癥反應(yīng),產(chǎn)生抗抑郁作用[11]。

MAPK1(又稱ERK2)為MAPK信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Rap 1主要是影響ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控基因表達(dá)[12]。ERK通路是MAPK諸多通路之一,參與炎癥反應(yīng)且與抑郁相關(guān)。MAPK通路通過(guò)磷酸化ERK1/2等信號(hào)分子,進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子表達(dá)。在FD發(fā)病表現(xiàn)中,上腹痛癥狀與幽門螺旋桿菌感染最相關(guān)[13],幽門螺旋桿菌可通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路,引起炎癥因子過(guò)度表達(dá),胃黏膜產(chǎn)生持續(xù)損傷[14]。ERK1/2信號(hào)通路調(diào)控下游腦源性神經(jīng)影響因子表達(dá),可對(duì)抑郁產(chǎn)生影響[15]。

經(jīng)以上分析可知,關(guān)鍵靶點(diǎn)分別與富集較大通路相對(duì)應(yīng),PI3K-AKT信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)產(chǎn)生NO,影響胃腸道動(dòng)力。Jak-STAT信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥因子水平,影響?zhàn)つp傷,改善抑郁。MAPK信號(hào)通路可調(diào)控炎癥反應(yīng),抑郁和疼痛敏化。結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果表明活性成分與作用靶點(diǎn)結(jié)合能力強(qiáng),表明運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)達(dá)立通顆粒治療FD作用機(jī)制研究可行。

綜上所述,本研究提示達(dá)立通顆粒活性成分作用于PIK3CA、AKT1、STAT3、MAPK1等相關(guān)靶點(diǎn),通過(guò)PI3K/AKT通路、MAPK通路、Jak-STAT通路等多個(gè)通路,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、胃腸動(dòng)力、抑郁情緒等作用治療FD。揭示了達(dá)立通顆粒治療FD的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,從理論層潛在分析了達(dá)立通顆粒治療FD的作用機(jī)制,體現(xiàn)了達(dá)立通顆粒多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同治療FD的特點(diǎn),為中醫(yī)藥治療FD的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。但本研究?jī)H在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)藥物對(duì)疾病的作用機(jī)制,還需進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),深入探究其具體作用機(jī)制。