樣品前處理技術在藥物元素雜質分析的應用探討

張士博,王歡,趙媛媛,周浩,李瑤,王慧潔

(正大天晴藥業集團股份有限公司,江蘇 南京 211100)

藥品中的元素雜質有多種來源,它們可能是在合成中有意添加的催化劑的殘留,也可能是實際存在的雜質(如:與生產設備或包裝系統相互作用產生的雜質或藥品各個組分中存在的雜質),因為額外引入的元素雜質不能為患者提供任何治療作用,所以它們在藥品中的含量需要被控制在可接受的限度范圍內。國家藥品監督管理局藥品審評中心近年來對元素雜質的控制要求越來越嚴,制藥企業需要按照ICH Q3D要求對藥物中的元素雜質進行定性和定量研究,并提供合理的元素雜質風險評估報告。在元素雜質分析中,首先需要采用合適的前處理方法將待測樣品制備為澄清透明的溶液,避免基質的干擾與揮發性元素雜質的損失,保證測試結果的準確性。根據實際研發經驗,結合樣品性質、元素性質和每種前處理技術的適用性,對元素雜質分析樣品前處理技術的選擇進行系統的分析與探討,旨在解決實際應用中存在的背景信號高、標準曲線差、加標樣品回收率差、加標樣品重復性差和元素殘留及記憶效應干擾等關鍵問題,提供科學的元素雜質分析樣品前處理方法選擇依據。

1 元素雜質分析樣品前處理方法

《美國藥典》(通則<233> 元素雜質-規程)收錄的樣品待測溶液制備方法有4類,即原樣直接分析、水溶液直接溶解、有機溶劑直接溶解和間接溶解,分析人員可采用任何經過適當驗證的樣品前處理方法,包括但不限于上述方法。有大量文獻報道[1-3]在元素雜質分析中,需要對樣品前處理方法進行選擇和優化,確保分析方法的準確性與可行性。李龍等人在地氯雷他定元素雜質測定時發現,當地氯雷他定未經處理直接進樣時,不僅會導致霧化器堵塞,有機成分離子還會干擾元素分子離子峰檢出[1],對樣品進行了微波消解后,不僅保證了儀器的正常運行,測試結果也準確可靠。

2023年4月,國家藥典委員會發布了《元素雜質限度和測定指導原則草案公示稿(第一次)》,在供試品制備中闡明液體供試品根據其基質、有機物含量和待測元素含量等情況,可選用直接測定或經稀釋、濃縮或消解后測定等不同方式;固體供試品一般需先制備成供試品溶液后方可用于測定,制備方法包括采用如水性溶液、有機溶劑或混合溶液進行溶解、稀釋等[4]。樣品前處理的主要目的是將待分析元素雜質全部溶解于樣品溶液中,除去或最大程度降低樣品中其他成分對測試結果的干擾,并保證處理過程中無其他影響因素引入。此外,應選擇操作簡便、安全性高、測試周期短及所用試劑易獲取、純度高的樣品前處理方法。

1.1 原樣直接分析

原樣直接分析適用于組成成分簡單的液體樣品且樣品中無元素雜質絡合位點,或所用分析方法可以允許檢查未溶解樣品,若采用電感耦合等離子體質譜法或電感耦合等離子體原子吸收法進行分析時,則要求樣品為水溶液且內容物含量較低。該方法的主要優點是操作簡便、檢測迅速且不需要對樣品進行任何處理,可以最大程度滿足檢測限需求。但是采用此法進行元素雜質分析時,需關注基質效應的影響及樣品在進樣系統的沉積。該方法主要適用于原料藥含量較低且基質簡單的吸入用液體制劑或注射液。

1.2 水溶液直接溶解

水溶液直接溶解適用于在水中完全溶解的樣品,一般用于結構簡單的起始物料、水溶性小分子輔料及注射液的元素雜質分析。該方法操作簡單,不需要其他特殊處理方式,只需將樣品溶解或稀釋,操作安全性高,不易產生污染。此法的主要缺點是不能確保樣品完全溶解,一些目視不能發現的不溶性微?？赡軙绊憸y試結果,需避免溶解的樣品在測試過程析出沉積于進樣系統。此外,部分元素雜質在水溶液中穩定性較差,可能會發生水解、沉淀、揮發等,例如銻元素和錫元素會水解產生沉淀,銀元素易與水中的氫氧根反應形成沉淀析出。因此,可考慮加入一定量鹽酸或穩定劑使元素雜質絡合,從而降低水解及沉淀的產生。耿悅等人采用水溶液直接溶解的樣品前處理方法,采用ICP-MS法測定了原料藥直接罐裝的注射用頭孢美唑鈉中31種元素雜質的含量,并指出對于溶解性好、成分簡單的物質而言,直接溶解法操作簡單,處理步驟較少,相比其他方法不容易引入污染[5]。

1.3 有機溶劑直接溶解

有機溶劑直接溶解需要采用特殊的測試配件,即有機進樣系統,一般應用較少。部分特殊制劑(例如脂肪乳)或無合適前處理方法時,考慮采用合適的有機溶劑溶解樣品,再采用合適溶液稀釋后進行測試。有些化學結構簡單且無元素雜質絡合位點的輔料、起始物料和中間體易溶于有機溶劑,可用合適的有機溶劑制備高濃度貯備液,再用水或者一定濃度的酸溶液稀釋后進行分析,對于揮發性和反應性強的元素雜質可獲得可靠的測試結果,可在研發初期用于元素雜質的風險評估與控制,節約測試時間與成本。

1.4 間接溶解

間接溶解是通過密閉或非密閉方式采用合適的無機酸在一定溫度下對樣品進行濕法消解,將樣品基質分解,使待分析元素雜質形成可溶性鹽。此法是目前應用最廣泛且國內外藥典均已收錄的元素雜質分析樣品前處理方法,特別適合結構復雜的原料藥及制劑成品的元素雜質分析[7]。硝酸是消解常用的酸,因為硝酸的氧化能力適當,硝酸鹽一般都溶于水。根據樣品基質,還可以加入過氧化氫、鹽酸、氫氟酸、高氯酸、磷酸或硫酸,采用混合酸消解[7]。微波消解法是常用的間接溶解法,與非密閉式消解方法相比,此法可以避免揮發性元素雜質的損失,且通過高溫高壓的反應方式,可以高效地破壞樣品基質,使元素雜質充分溶解于溶液中。采用微波消解法處理樣品時,需避免消解罐重復使用帶來的交叉污染及密閉消解的安全性風險。建議采用一定濃度的硝酸將消解罐浸泡后,再用去離子水反復沖洗,烘干后再加適量硝酸進行微波消解清洗,最大限度避免離子污染。郭雅娟等人采用間接溶解(微波消解)樣品前處理方法,并加入了穩定劑金元素防止揮發性元素汞的損失,測定了甘露醇中元素雜質的殘留量,并指出對于有機化學物質,通常需要經過濕法消解確保較低的炭殘留(CBB)[8]。

2 樣品前處理技術的選擇

每種樣品前處理方法均有自己的適用性與優缺點,需要將樣品性質、目標元素性質和研究目的等信息進行充分的信息整合,選擇合適的樣品前處理方法,并通過合理的預實驗評估目標元素在消解液中的穩定性,進行影響因素排查,確認測試結果的準確度和精密度。

樣品性質分析主要包括樣品來源、物理性質和化學性質。樣品來源主要有物料、中間體、輔料、原料藥、制劑成品等,根據樣品來源可初步確定是否需要進行準確的元素雜質定量分析,如果是初步評估,則可選擇操作簡便、分析速度快的樣品前處理方法,如原樣直接分析、水溶液直接溶解和有機溶劑直接溶解。物理性質需關注樣品狀態、溶解性和均一性,若樣品為單一成分或成分簡單的水溶液,可優先嘗試原樣直接分析法。若樣品為固體狀態,則需了解樣品的溶解性和均一性,根據控制需求選擇樣品處理方法。化學性質是為了排查是否存在與酸發生反應的基團及其他敏感化學基團,避免在消解過程發生安全事故,常見的帶有反應基團的樣品有臭氧化合物、疊氮化合物、重氮化合物、雷酸鹽、過氧化物等。常見帶有敏感基團的樣品有乙炔化合物、甘油、強還原劑、硝酸甘油酯、二元醇等。這些帶有反應基團和敏感基團的樣品在密閉高溫的環境下可能發生爆炸反應,故不適合采用密閉的濕法消解方式進行樣品前處理。

目標元素性質分析首先要明確元素雜質的潛在來源,即待測元素是在原料藥、輔料或其他藥品組分生產中有意添加元素(如催化劑的殘留)或通過其他途徑(如試劑殘留、生產設備、包裝系統等)引入的非有意添加元素。有意添加的元素或引入風險較高的元素需要按照ICH Q3D進行控制與風險評估,對于樣品前處理方法的要求較高,推薦采用密閉消解方式。此外,需要考慮目標元素的揮發性、是否會和樣品發生絡合及前處理和測試注意事項。對于汞、硒、鋨等易揮發元素,宜采用密閉消解形式,如濕法消解和微波消解,且在趕酸過程中,應使用較低溫度,降低元素雜質損失。部分元素雜質會與樣品中孤對電子形成配位鍵或與特定基團發生絡合,如鈀元素會和N、O、S的孤對電子構成與小分子螯合物相似的穩定結構,可通過在樣品處理過程加入鹽酸使鈀元素與氯離子形成穩定的氯鈀絡陰離子或加入硫脲作為穩定劑,保證分析結果的準確性。采用電感耦合等離子體質譜法分析時,在測試過程中應避免多原子離子的產生,選擇合適質量數和KED模式進行測試。例如砷元素受ArCl干擾十分強烈,因此在對樣品消解時,應盡量避免使用鹽酸。

預實驗可以有效地評估前處理方法的可靠性和準確性,通過測試空白試劑、供試品溶液、一定濃度的元素標準溶液和供試品添加一定量的元素標準溶液,可以確認分析方法是否受基質效應、其他元素雜質和污染(試劑污染、容器污染、樣品處理過程污染)影響。此外,可以制備多份供試品和供試品添加一定量的元素標準溶液,進一步確認樣品前處理過程是否穩定及原始樣品的均一性。最終確定的分析方法必須進行方法驗證,驗證項目包括專屬性、線性及范圍、準確度、重復性、中間精密度、重現性、定量限、檢測限及耐用性,以證明樣品前處理技術和測試方法滿足既定元素雜質分析的目的。

將藥品整個生產過程中的元素雜質樣品前處理技術總結為4類,即原樣直接分析、水溶液直接溶解、有機溶劑直接溶解和間接溶解,并根據供試品特性、待測元素性質、基質特點等繪制了元素雜質樣品前處理技術選擇流程圖,如圖1所示。采用電感耦合等離子體原子發射光譜、電感耦合等離子體質譜法及原子吸收分光光度法進行元素雜質測試時,可參照該流程圖進行樣品前處理。

圖1 元素雜質樣品前處理技術選擇流程圖

3 結論

藥品中額外引入的元素雜質不僅無任何治療作用,有些雜質還具有一定毒性,例如ICH Q3D規定的1類元素,這類元素是對人體有害的,在藥品生產中禁用或限制使用。在藥品生產過程中使用的原輔料、催化劑、生產設備和包裝材料等都可能會引入一些元素雜質,制藥企業必須將藥品中的元素雜質控制在可接受的限度范圍。測定元素雜質的前提是選擇合適的樣品前處理方法,確保測試結果的準確性。重點介紹了主要的元素雜質分析樣品前處理技術及適用性,并在此基礎上總結了元素雜質分析樣品前處理技術選擇的新思路。建議藥品研發人員根據供試品的理化性質及基質特點、待測元素性質及控制限度要求和研究目的,選擇合理的樣品前處理技術,不僅可以有效制備待測元素分析溶液,還可以排除其他干擾因素,避免復雜樣品對儀器的污染及損傷,保證分析方法的靈敏度、準確度和精密度。