聚蘋果酸的微生物合成及其應用研究進展

李佳逸,康建平,2*,譚 昕,2,何雨靜,2,王燕來,何 勇

(1.四川省紡織科學研究院有限公司,四川 成都 610000;2.高技術有機纖維四川省重點實驗室,四川 成都 610000)

聚蘋果酸(Poly Malic acid,PMLA)又名聚羥基丁二酸酯,是一種具有良好生物相容性及生物降解性的水溶性脂肪族聚酯類化合物。PMLA 是以重復的L-蘋果酸為單體,通過—OH 和α-或β-COOH 形成的酯鍵聚合而成,主要有3 種構型:α 型、β型、γ 型,如圖1[1]所示。由于PMLA 側鏈存在大量游離的羧基,容易被修飾或改性,與具有功能分子的活性基團相結合,從而使其附有特殊功能[2],因此在生物醫藥、食品、化妝品等領域具有廣泛的應用前景[3]。

圖1 蘋果酸和PMLA 的3種構型

目前,聚蘋果酸的合成方法主要分為化學合成法和生物合成法。化學合成法主要有開環聚合法和直接聚合法,可以得到3種構型的PMLA,其中開環聚合法技術較為成熟。但與生物合成法相比,化學法合成的PMLA 分子量較小,合成步驟長,提純工藝復雜,嚴重制約了其規模化發展。微生物合成法是由微生物體內通過三羧酸循環代謝僅存有β-型,能得到相對分子量較大的PMLA,且具有較高的化學純度和光學純度,性能優異,成為當前的研究熱點?？偨Y國內外近年來關于微生物合成β-PMLA 及其應用的相關研究,為更加深入利用生物法合成PMLA 提供策略。

1 微生物法合成聚蘋果酸

微生物發酵可以持續產生PMLA,Shimada等[4]在1969 年首次發現了從圓弧青霉(Penicillium cyclopium)中分離得到的以蘋果酸為結構單元的一種聚合物對蛋白酶具有抑制作用,這種聚合物后來被證實為PMLA。隨后,Fischer 等[5]從多頭絨泡菌(Physarumpolycephalum)中分離到PMLA,發現其可抑制α型DNA 聚合酶活性。到目前為止,生物法合成PMLA 的研究菌株主要存在于黏菌科多頭絨泡菌和短梗霉屬。多頭絨泡菌是一種多形態真菌,PMLA主要產生于其原質團時期,多核原質團以L-蘋果酸為前體,在聚合酶的催化下才能合成分子量為10～300 k Da的PMLA,且產量較低,難以滿足工業應用。目前對多頭絨泡菌合成聚蘋果酸的研究多集中在合成及代謝調控方面[6],由于其產量較低,在發酵法合成方面的研究較少。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是一種具有酵母型和菌絲形態的的多型真菌,其形態較黏菌相對穩定,合成PMLA 的能力也相對較強[7]。

1.1 出芽短梗霉發酵產β-聚蘋果酸

Nagata等[8]篩選鑒定了一株出芽短梗霉在以甘露糖為碳源的選擇培養基中產生了一種來源于葡萄糖的β型胞外聚酯,后被證實其單體為L-蘋果酸。出芽短梗霉合成的PMLA 分為兩部分,其中一部分以β-PMLA-葡聚糖結合體的形式分泌,另一部分被分解為分子量5～10 k Da的自由β-PMLA,分泌到細胞外。徐玲芬等[9]從自然界中的樹皮、樹葉等樣本中分離得到一株高產PMLA 菌株,經鑒定屬于出芽短梗霉菌,以葡萄糖為碳源,發酵產量達到26.23 g/L。Xia等[10]通過添加1% (w/v)大豆油使A.pullulans發酵產生的PMLA 濃度和產率分別提高了34.2%和80%。

1.2 出芽短梗霉合成PMLA代謝途徑

出芽短梗霉合成PMLA 主要途徑包括TCA 循環和乙醛酸途徑,L-蘋果酸作為PMLA 唯一單體,與PMLA 合成效率有著密切的關系。蘋果酸是TCA 循環中的關鍵中間體,經延胡索酸酶催化生成,隨后在線粒體內經蘋果酸脫氫酶(m MDH)催化轉化為草酰乙酸。在乙醛酸循環中,蘋果酸合成酶(MSE)能夠催化乙醛酸和乙酰輔酶A 縮合成蘋果酸,如圖2所示[11]。

圖2 出芽短梗霉PMLA 合成途徑

L-蘋果酸能夠在添加外源性碳酸鹽時,通過細胞質中的還原途徑產生,丙酮酸會被丙酮酸羧化酶先一步羧化為草酰乙酸,然后再被蘋果酸脫氫酶進一步還原成蘋果酸。因此,在出芽短梗霉發酵培養基中通常會添加CaCO3以提高PMLA 產量。值得注意的是,CaCO3的缺失或不足會導致出芽短梗霉能夠合成其他多種胞外產物,如普魯蘭多糖、淀粉酶等。

2 聚蘋果酸的發酵調控

2.1 培養基成分

PMLA 發酵培養基的主要成分有碳源、氮源、無機鹽和有機酸,碳源和氮源是微生物生長代謝的主要營養物質,低濃度的無機鹽能夠促進細胞的生長和產物合成。常用的碳源有葡萄糖、淀粉、蔗糖等,除此之外也有不少學者通過利用生物質作為碳源發酵產生PMLA,以降低發酵原料的成本,從而降低聚蘋果酸的生產成本。Timothy等[12]使用H2O2預處理小麥秸稈,當在含有5%的小麥秸稈發酵液中加入3%CaCO3時,獲得23.5 g/L的聚蘋果酸產量。Wei等[13]通過在5 L發酵罐中分批補料發酵,以稀釋后的甘蔗糖蜜作為營養物質,不添加其他額外的成分,即可滿足發酵需求,PMLA,產量達到1 163 g/L。Liu等[14]通過出芽短梗霉ZD-3d以分批補料的發酵方式,在木薯原料水解液中生成PMLA,產量達到101.9 g/L。

幾乎所有的氮源都能促進PMLA 發酵,但發酵產量有所差異,靳挺等[15]研究以硫酸銨、尿素、丁二酸胺作為氮源發酵產PMLA,結果表明這3種氮源均能提高PMLA 產量,其中丁二酸作為氮源時產量最高。吳艷麗等[16]通過單因素實驗研究了最佳碳源、氮源和碳酸鈣添加量,并進行Box-Benhken實驗,得到最優發酵培養基成分為120 g/L葡萄糖,3.02 g/L丁二酸胺,30 g/L CaCO3,p H 值4.68 時PMLA 產量最大達到17.48 g/L。

2.2 添加酶抑制劑、輔因子

通過平衡TCA 循環和乙醛酸途徑之間的代謝流量,并調控中間代謝產物的量,可以提高菌株利用碳源合成β-PMLA 的效率。Liu等[17]在研究中發現,向發酵培養基中添加馬來酸、丙二酸、蘋果酸和琥珀酸可促進PMLA 的合成,在添加三氟乙酸的情況下則有抑制作用。相比對照組,添加20 g/L琥珀酸可以使PMLA產量提高44%。推測原因是丙二酸競爭性抑制琥珀酸脫氫酶,導致TCA 循環的代謝通量流經乙醛酸循環,從而能夠提高PMLA 合成產量。Zuo等[18]研究發現向培養基中補充TCA 還原途徑的輔助因子生物素和CO2供體可以提高PMLA 的產量。喬長晟等[19]比較野生出芽短梗霉菌株TKPM00006和誘變菌株CGMCC30007在相同發酵條件下的關鍵酶活,結果表明CGMCC30007的丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫羧酶活力分別提高了29%和18%。與Liu等的研究結果一致的是,添加三氟乙酸會抑制TCA 循環和乙醚酸循環,導致PMA 的合成產量下降25.7%。

2.3 發酵條件

提高PMLA 發酵產量除了篩選高產菌株外,菌株發酵培養條件,如溫度、p H 值、攪拌轉速和不同補料方式對發酵產量的影響也十分重要。

發酵溫度是影響微生物生長和代謝產物產量的重要因素。對于出芽短梗霉來說,一般在適宜的溫度范圍內進行發酵,通常在25～30 ℃之間。陳曦等[20]通過單因素實驗優化出芽短梗霉BK-10培養條件,得出結論:最佳發酵溫度26 ℃,250 m L搖瓶裝液量50 m L時,生產強度達到0.89 g/(L·h)。

p H 值是另一個重要的因素,直接影響微生物的生長和代謝產物的產量。對于出芽短梗霉來說,適宜的p H 值范圍一般在4.5～6.5之間。王麗燕等[21]通過搖瓶實驗研究了A.pullulansBS02最優培養條件為:以葡萄糖為碳源,添加50 g/L CaCO3,在p H 值4.0～5.0、溫度24 ℃下發酵培養10 d,其產量達到30 g/L。

發酵罐發酵時攪拌器的作用是改善通氣效率,改變溶氧。出芽短梗霉作為強好氧菌,發酵過程中溶氧越高越有利于菌體生長。Cao等[22]發現通過調節不同發酵階段溶氧可以提升出芽短梗霉ipe-1合成PMLA的產量。

微生物的生長繁殖離不開養分的供給,但過量的碳源、氮源會導致菌體過量繁殖,過早衰老、自溶,致使目標產物合成效率降低。合理的補料方式可以提供適當的養分供給,促進發酵過程的穩定和高效進行,從而提高發酵產物的質量和產量。昝占全[23]在研究出芽短梗霉A.pullulanFMT1801發酵甘薯淀粉水解液產PMLA 時發現在發酵過程中隨著底物的不斷消耗,發酵72 h時殘糖較低,不足以供應發酵菌株合成PMLA,所以考慮補料培養,通過分批補料的方式,PMLA產量提高了42.4%。

3 聚蘋果酸的應用

3.1 藥物載體

PMLA 具有較高的溶解性、生物相容性和優良的生物可降解性,能夠包裹藥物與特性的組織特異性標記物共價結合,從而控制藥物釋放的時間和部位。Abdellaui等[24]通過酰胺鍵鏈接PMLA 與抗癌藥物Dox,形成穩定的靶向給藥系統,使載體在滲透進髓細胞K562細胞核后才將藥物釋放。喬友備[25]通過在β-聚蘋果酸主鏈上引入酰胺鍵修飾羥基喜樹堿,得到聚蘋果酸-羥基喜樹堿軛合物,該軛合物能夠有效改善羥基喜樹堿的溶解性能。

3.2 生物醫學材料

PMLA 及其衍生物優異的可降解性和生物可吸收性使其可以用于制備手術縫合線、固體藥物包裝、骨骼修復等生物醫學材料。Michel[26]通過研究PMLA 改性制備的透析袋性能,發現其具有較高的膠體滲透壓,能夠代替具有毒性的傳統聚硅酮腹膜透析袋。李世普等[27]利用PMLA 作為主鏈,通過接枝導電基團和可降解基團的改造,研發了一種既可降解又導電的生物醫用高分子材料。這種材料可以用于生產導管、縫合線、薄膜及組織工程支架等多種生物醫學材料。Viviane等[28]研究發現以PMLA 保護的肝素結合生長因子具有高效誘導骨生成能力。

3.3 食品添加劑

PMLA 熱水解產物L-蘋果酸是一種天然有機酸,其風味與蘋果酸味相似,較為柔和,因此可以被用于酸味劑。同時,L-蘋果酸作為三羧酸循環和乙醛酸循環的中間代謝產物,可以被人體直接吸收,從而為機體供能,被用于食品保健領域。

4 展 望

4.1 PMLA具有優良特性,開發潛力巨大

目前PMLA 供應量較少,因此關于其應用研究也較少。但是PMLA 具有優良的可生物降解性、生物相容性及易修飾性質,在生物醫藥、生物材料、紡織等領域有著巨大的應用潛力。Qiu等[29]通過采用環保疏水的二元醇1,8-辛二醇作為交聯劑,在PMLA 中構建無定形網絡,提高PMLA 力學性能的同時,也賦予了PMLA 形狀記憶效應。因此推測后續可應用于形狀記憶紡織品中,填補PMLA 在紡織品領域應用的空白。

4.2 PMLA合成存在技術瓶頸,規?；a難度極大

目前聚蘋果酸的生產能力仍然較低,化學法生產成本高,環境污染大;生物法發酵菌株出芽短梗霉生長繁殖速度慢,發酵周期長,產物提純難,導致PMLA 還沒有大規模應用。

4.3 PMLA微生物合成法潛力大,研究前景廣闊

在PMLA 微生物合成法后續的研究中,如優化代謝途徑、誘變選育穩定高產菌株、優化發酵條件,進一步提高菌株微生物合成PMLA 的能力及分子量,減少反應中副產物的合成成為主要研究方向。相信隨著研究的不斷深入,微生物法合成聚蘋果酸工業化指日可待。