1p36與12q24隱匿性易位致多發畸形胎兒的遺傳學分析

林俊生, 葉怡虹, 盧娉霞, 胡倩, 葉婷婷, 陳加弟, 曹穎平

遺傳學因素是導致先天畸形的重要因素之一[1-2]。臨床上對于先天畸形的遺傳學檢測方法主要有常規核型分析(conventional cytogenetic analysis, CCA)、單核苷酸多態性微陣列(single nucleotide polymorphism microarray, SNP)分析和熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)技術。CCA雖然能夠分析全部染色體,但其只能檢測大片段異常(>10 Mb),無法檢測小片段的插入、倒位、微缺失和微重復,而且對于區帶相似、片段大小相近的大片段染色體隱匿性易位也不易檢出[3]。SNP技術作為CCA的重要補充,可以檢測CCA難以檢測出的染色體微缺失和微重復,但是無法檢測平衡易位。FISH技術雖然能夠檢測平衡易位,尤其是隱匿性易位,但是只能分析已知序列的染色體異常,無法實現全基因組檢測。本研究聯合CCA、SNP和FISH技術對攜帶有罕見隱匿性染色體異常的胎兒進行遺傳學分析,并為父母再生育提供遺傳咨詢。

1 資料與方法

1.1 一般資料 胎兒母親年齡28歲,2019年3月孕16周左右胚胎停育。本次妊娠為宮內單胎妊娠,因胎兒超聲異常于19周行產前診斷。孕19+6周三維超聲提示,胎兒腦積水、臍靜脈走行異常(持續性右臍靜脈?)、心肌回聲稍增強、局部腸管回聲稍增強;孕22+3周三維超聲提示,胎兒各生長徑線測值均小于相應孕周,存在胎兒腦積水、復雜心臟畸形(室間隔缺損、主動脈增寬騎跨、肺動脈狹窄——法洛四聯癥?)、永存左上腔靜脈、持續性右臍靜脈、雙側腎盂分離、臍帶繞頸。胎兒父母為非近親婚配。本研究經筆者醫院倫理委員會批準(2023KY200)。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 羊水細胞培養基(BM1013-10,杭州寶榮科技有限公司);FISH探針試劑盒(S500-24,美國雅培公司);QIAamp DNA Mini Kit(51304,德國 QIAGEN公司);CytoScanTMHD芯片及試劑盒(901859,美國Affmetrix公司)。實時熒光定量PCR擴增儀(7900,美國ABI公司);分光光度計(NanoDrop 2000/2000c)和GeneChipTM雜交爐(Applied Biosystems)(美國賽默飛公司);基因芯片全自動洗滌工作站(Affymetrix 7G)和高分辨率芯片掃描儀(Affymetrix Genechip Scanner 3000)(美國 Affmetrix公司)。

1.2.2 顯帶核型分析技術檢測染色體核型 抽取羊水及胎兒父母外周血,按照常規方法制備染色體,利用G顯帶技術進行顯帶。利用Cytoversion軟件(LeicaGSL120,德國萊卡公司)進行分析,按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2018)進行描述。

1.2.3 SNP檢測 提取羊水細胞及父母外周血核酸,進行SNP測序操作,并利用DECIPHER數據庫、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)和美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)等在線數據庫對異常染色體進行分析,并判讀結果。

1.2.4 中期FISH技術檢測 根據操作手冊,分別利用FISH探針進行雜交和檢測,其中1號和12號短臂末端信號均為綠色,長臂末端信號均為紅色。

2 結 果

2.1 CCA結果 CCA檢測結果顯示,胎兒、母親和父親均未見染色體異常(圖1)。

A：胎兒染色體核型分析結果為46,XX;B：母親染色體核型分析結果為46,XX;C：父親染色體核型分析結果為46,XY。

2.2 SNP分析結果 胎兒SNP檢測結果：arr[hg19]Xp22.12(20,212,014-20,718,134)x3, 1p36.33p36.13 (849,466-16,724,642)x1, 12q24.31q24.33 (122,915,078-133,777,562) x3,提示本例為Xp22.12(506.1 kb)片段重復、1p36.33p36.13缺失和12q24.31q24.33重復的胎兒。Xp22.12區段含有RPS6KA3(300075) 基因部分片段(圖2A),1p36.33p36.13內含GABRD(137163)、PRDM16 (605557)和SKI(164780)等147個OMIM基因(圖2B),12q24.31q24.33區段內含PUS1 (608109)和ANKLE2 (616062)等56個OMIM基因(圖2C)。母親SNP結果正常。父親SNP結果顯示,Xp22.12(506.1 kb)片段重復,與胎兒X染色體SNP檢測結果一致,但父親無臨床表型,提示該片段重復不是胎兒超聲畸形的遺傳因素。1p36.33p36.13缺失和12q24.31q24.33重復可能是由于父母一方攜帶t(1;12)(1p36.13;12q24.31)所致。

SNP：單核苷酸多態性微陣列。A：X染色體重復,Xp22.12存在506.1 kb重復;B：1號染色體缺失,1p36.33p36.13區段存在15.8 Mb片段缺失;C：12號染色體重復,12q24.31q24.33區段存在10.8 Mb片段重復。

2.3 FISH技術檢測結果 胎兒羊水中期FISH檢測結果顯示：2條12號染色體均正常;2條1號染色體中,1條正常,1條為衍生染色體,為ish der(1)t(1;12)(12q+,1q+),即1號染色體于1p36.13斷裂丟失,并連接上來自于12號染色體12q24.31q24.33片段(圖3A、B)。母親外周血中期FISH檢測結果顯示：ish t(1;12)(12q+,1q+;12p+,1p+)(圖3C、D)。父親FISH檢測結果為正常(圖3E、F)。

FISH：熒光原位雜交。A、B：胎兒FISH結果為ish der(1)t(1;12)(12q+,1q+)(紅色箭頭所指為異常染色體);C、D：母親FISH結果為ish t(1;12)(12q+,1q+;12p+,1p+)(紅色箭頭所指為異常染色體);E、F：胎兒父親FISH檢測結果未見異常。

2.4 遺傳咨詢 綜合CCA、SNP技術和FISH檢測結果,明確胎兒核型為46,XX, der(1)t(1;12)(1p36.13;12q24.31);母親核型為46,XX, t(1;12)(1p36.13;12q24.31);父親核型為46,XY。結合胎兒超聲檢查結果異常,孕婦及家屬選擇終止妊娠。經醫院倫理委員會討論,于妊娠28周時進行引產。

3 討 論

CCA雖然是胎兒染色體疾病產前診斷的“金標準”,但其無法檢測微缺失、微重復以及隱匿性染色體相互易位[4-5]。隱匿性染色體相互易位指在光學顯微鏡下無法辨認的微小或條帶相似的染色體片段的易位[6]。聯合SNP和FISH技術可以檢測CCA不易檢測的染色體隱匿性易位,為患者提供更為全面和準確的產前遺傳學診斷。本次研究聯合CCA、SNP和FISH技術對該多發畸形胎兒進行遺傳學產前診斷。

胎兒CCA分析結果顯示,未見染色體異常,但是超聲顯示胎兒為多發畸形。SNP結果為Xp22.12重復(506.1 kb)、1p36.33p36.13缺失(15.8 Mb)和12q24.31q24.33重復(10.8 Mb),提示胎兒父母之一可能為1號和12號染色體易位的攜帶者。FISH結果明確胎兒遺傳了因母親攜帶隱匿性易位形成的衍生1號染色體der(1)t(1;12)(1p36.13;12q24.31)。相互易位的片段均大于10 Mb,理論上利用CCA可檢測出來,但是由于1p36.33p36.13和12q24.31q24.33的G顯帶帶紋均為淺帶,很相似,兩者的易位使用CCA技術難以檢測。本次聯合應用CCA、SNP和FISH技術,成功診斷出攜帶有隱匿性染色體變化的胎兒。CCA結果父親為46,XY,母親為46,XX,FISH檢測發現,母親存在隱匿性易位,胎兒母親理論上在減數分裂會形成18種配子,生育正常胎兒為1/18,生育表型正常的攜帶者概率為1/18,其余16/18均為染色體不平衡易位。因此該母親再次妊娠時,應進行遺傳學咨詢。

胎兒Xp22.12發生506.1 kb的重復,內含RPS6KA3基因的部分片段,該基因突變與X染色體連鎖顯性遺傳的Coffin-Lowry綜合征等疾病相關[7-8],但該片段重復與胎兒的臨床表型是否相關尚不明確。父母SNP結果顯示,該片段遺傳自父親,父親無異常表型,推測Xp22.12發生506.1 kb的重復不是胎兒致畸的遺傳學因素。

胎兒在1p36.33p36.13發生15.8 Mb片段的缺失,內含GABRD、PRDM16、SKI等147個OMIM基因,通過數據庫分析,提示1p36.33p36.13為致病性,主要涉及1p36缺失綜合征,又稱為1p36單體[9]。1p36缺失綜合征是最常見的染色體亞端粒區域微缺失,在活產新生兒中發病率約為1/5 000,于1980年由HAIN等[10]首次報道。SHAPIRA等[11]發現,1p36缺失綜合征患者具有典型的臨床表型：面容異常、前囟閉合延遲、細發絲、內眥贅皮、短指/先天性指屈曲、短足、身材矮小、不同程度的發育遲緩和智力障礙等。季修慶等[12]和劉慧麗等[13]也發現,1p36缺失綜合征具有典型面容特征、智力障礙,尤其是語言發育落后和矮小等特點。

胎兒在12q24.31q24.33發生10.8 Mb片段的重復,內含PUS1和ANKLE2等56個OMIM基因。12號染色體長臂末端部分三體綜合征是一種非常罕見的染色體異常。李紅嫵[14]報道1例12q24三體胎兒存在先天畸形,出生后14 d死亡。數據庫分析顯示,PUS1基因純合突變與常染色體隱性遺傳的乳酸酸中毒性肌病并鐵粒幼細胞貧血1型疾病相關,臨床表型包括生長發育異常、小頭畸形、肌無力和智力障礙等[15]。ANKLE2基因純合或復合雜合突變與常染色體隱性遺傳的原發性小頭畸形16型疾病相關,臨床表型包括身材矮小、小頭畸形、上瞼下垂以及隱睪癥等[16]。胎兒孕20周三維彩超結果顯示,胎兒雙側側腦室擴張(1.4 cm)、持續性右臍靜脈、心肌回聲稍增強、局部腸管回聲稍增強,可能與1p末端缺失和12q末端重復有關。

綜上所述,本研究通過聯合應用CCA、SNP和FISH技術,對攜帶有隱匿性易位導致胎兒染色體發生隱匿性結構異常的患者進行分析,明確了CCA和SNP結果不一致的原因,以及1p36.33p36.13缺失(15.8 Mb)和12q24.31q24.33重復(10.8 Mb)是該胎兒畸形的遺傳學病因。因此,產前診斷時應用多種遺傳學診斷技術進行綜合判斷,可為臨床提供更準確的遺傳信息,有利于遺傳缺陷胎兒的診斷。