靈芝總三萜富集用不同型號大孔吸附樹脂的篩選

陳婧 羅欣 鐘海燕 劉澤湞 李鵬

（福建醫科大學藥學院 福州 350122）

赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.]為多孔菌科真菌的干燥子實體，是一種傳統中藥材，使用歷史非常悠久[1]。靈芝含有三萜、多糖、生物堿、黃酮、甾醇、蛋白質、氨基酸等多種類型的化學成分[2]。羊毛甾烷型四環三萜類成分是其主要的生物活性成分之一，具有抗腫瘤、抗炎、保肝、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗輻射、逆轉腫瘤多藥耐藥等多種藥理作用[3]。大孔吸附樹脂已廣泛用于富集藥用真菌的有效成分，如核苷類、黃酮類、生物堿類、三萜類、酚類、蛋白質和肽類[4]。近年來，大孔吸附樹脂已有用于靈芝三萜類物質分離純化工作。周曉[5]利用AB-8樹脂對靈芝三萜粗提液進行分離純化。陳慧[6]和王濤[7]選取ADS-8大孔樹脂用于靈芝三萜的分離純化。但是關于靈芝總三萜富集用的大孔吸附樹脂的篩選研究報道較少。針對文獻中已用于三萜類物質純化的8種大孔吸附樹脂（HPD400、HPD500、D101、D4020、LSA-21、DM301、HZ816及HP-20），本研究比較這些樹脂對靈芝總三萜的吸附與解吸附能力，從中篩選出用于富集靈芝總三萜的合適樹脂，為后續利用大孔吸附樹脂純化靈芝三萜的研究工作奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑與材料

ZQTY-50振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）；Cary 300紫外可見分光光度計（安捷倫科技有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；R-100旋轉蒸發儀（瑞士步琦有限公司）；SHB-III循環水式多用真空泵（福州泰美實驗儀器有限公司）；XS105型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

大孔吸附樹脂購自上海源葉生物科技有限公司，型號規格詳見表 1；95%乙醇、乙酸乙酯、甲醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；冰醋酸（AR，西隴科學股份有限公司）；高氯酸（AR，成都金山化學試劑有限公司）；香草醛（AR，上海麥克林生化科技有限公司）；齊墩果酸對照品（AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；赤芝藥材（福建仙芝樓生物科技有限公司提供，經福建醫科大學藥學院天然藥物學系張永紅教授鑒定，藥材標本現存于福建醫科大學福建省天然藥物藥理學重點實驗室）。

表1 實驗所使用的苯乙烯型大孔吸附樹脂的一般性能

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝總三萜母液的制備

準確稱取靈芝粉末500 g于5 000 mL的圓底燒瓶中，加入3 000 mL 95%乙醇，95 ℃回流提取3次，每次2 h。合并3次提取液并過濾，濾液減壓濃縮，真空干燥，稱重，得醇提浸膏（24.47 g）。將醇提浸膏用60%乙醇溶解，并定容至1 000 mL，即得靈芝總三萜母液。

1.2.2 靈芝總三萜含量測定

1）標準曲線的繪制 參考2020版《中國藥典》靈芝項下三萜含量測定方法[8]，精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品5.0 mg于25 mL量瓶中，加甲醇溶解后，定容至刻度，配制成0.2 mg/mL的對照品溶液。分別吸取對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于5 mL具塞試管中，不加塞，水浴揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸0.8 mL，加塞，搖勻，在70 ℃恒溫水浴中加熱15 min后，立即置冰水浴中冷卻5 min，再加入乙酸乙酯使總量為5 mL，搖勻，以相應試劑為空白，在546 nm處測定吸光度。以吸光度值(A)為縱坐標，齊墩果酸濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線。

2）精密度測定 取0.02 mL靈芝總三萜母液于5 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑后，按 “1.2.2項1）標準曲線的繪制”的方法，測定其吸光度6次。

3）穩定性測定 取0.02 mL靈芝總三萜母液于5 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑后，按 “1.2.2項1）標準曲線的繪制”的方法，分別在室溫下放置5、10、15、20、25、30、35、40、45 min后測定其吸光度。

4）重復性測定 取0.02 mL靈芝總三萜母液6份，分別置于編有1、2、3、4、5、6號的5 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑后，按“1.2.2項1）標準曲線的繪制”的方法，測定其吸光度。

5）回收率測定 取0.02 mL靈芝總三萜母液6份，分別置于編有1、2、3、4、5、6號的5 mL具塞試管中，在1、2號管中加入0.1 mL齊墩果酸對照品，在3、4號管中加入0.15 mL齊墩果酸對照品，在5、6號管中加入0.2 mL齊墩果酸對照品，分別搖勻，水浴揮干溶劑后，按“1.2.2項1）標準曲線的繪制”的方法，測定其吸光度（齊墩果酸對照品濃度為0.22 mg/mL）。

回收率（%）=（C－A)/B×100%。

式中：A為加入樣品量(mg)，B為加入標準品量(mg)，C為測得量(mg)。

6）母液中靈芝總三萜含量測定 精密移取靈芝總三萜母液0.02 mL于5 mL具塞試管中，不加塞，揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸0.8 mL，加塞，搖勻在70 ℃恒溫水浴中加熱15 min后，立即置冰浴中冷卻5 min，再加入乙酸乙酯使總量為5 mL，搖勻，以相應試劑為空白，在546 nm處測定吸光度，將吸光度值（A）代入回歸方程，計算靈芝總三萜母液中總三萜的含量，平行實驗3次。

1.2.3 靜態吸附-解吸實驗

1）大孔吸附樹脂預處理 各型號大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24 h，待溶脹完全后，濕法裝柱，用95%乙醇洗脫直至溜出液與蒸餾水按體積比1∶4混合后不呈現白色渾濁，然后用大量的蒸餾水洗脫，直至溜出液無醇味，濕法密封保存待用。

2）靜態吸附考察 準確量取預處理過的大孔吸附樹脂HPD400、HPD500、D101、D4020、LSA-21、DM301、HZ816及HP-20各10 mL于250 mL錐形瓶中，分別準確量取靈芝總三萜母液30 mL加于各錐形瓶中，另量取30 mL靈芝總三萜母液于250 mL錐形瓶（不含樹脂）作為空白對照組，用保鮮膜和膠布封口后，置于振蕩培養箱中，100 r/min，25 ℃，振搖24 h，抽濾，濾液備用。各取濾液0.04 mL，按“1.2.2項6）母液中靈芝總三萜含量測定”的方法，分別測定空白對照組與各型號大孔吸附樹脂吸附后濾液中靈芝總三萜的含量，計算各大孔吸附樹脂對靈芝總三萜的吸附量和吸附率。

吸附量＝空白對照組中總三萜含量－濾液中總三萜含量；吸附率＝(空白對照組中總三萜含量－濾液中總三萜含量)/空白對照組中總三萜含量×100%。

3）靜態解吸考察 將“1.2.3”項2）中通過過濾得到的已吸附靈芝三萜的8種樹脂分別完全轉移入250 mL錐形瓶中，再分別加入50 mL的95%乙醇，用保鮮膜和膠布封口后，置于振蕩培養箱中，100 r/min，25 ℃，振搖24 h，抽濾，濾液備用。各取濾液0.08 mL，按“1.2.2項6）母液中靈芝總三萜含量測定”的方法，測定各型號大孔吸附樹脂解吸附后對應濾液中靈芝總三萜的含量，計算解吸率。

解吸率（%）＝解吸后濾液中總三萜的含量/吸附量×100%。

2 結果

2.1 靈芝總三萜母液中總三萜含量

2.1.1 精密度測定

結果表明，儀器精密度良好（表2）。

表2 精密度測定

2.1.2 穩定性測定

結果表明，在樣本配制后5～45 min內進行測定，穩定性良好（表3）。

表3 穩定性測定

2.1.3 重復性測定

結果表明，方法重復性良好（表4）。

表4 重復性測定

2.1.4 回收率測定

結果表明，方法回收率良好（表5）。

表5 回收率測定

2.1.5 靈芝總三萜母液中總三萜含量

齊墩果酸濃度于4～20 μg/mL范圍內與其吸光度值線性關系良好，其標準曲線回歸方程為A=0.011 8+0.032 67C，r=0.999 5。經3次重復實驗，測得靈芝總三萜母液中總三萜平均含量為2.46 mg/mL（表6）。樣品測定前，我們考察了母液中的非三萜有色物質是否會干擾測定結果。取0.02 mL母液于5 mL具塞試管中，再加入無水乙醇使總量為5 mL，搖勻，以相應試劑為空白，在546 nm波長處測定吸光度為0.003，因此，母液中的非三萜類有色物質不會對三萜的測定產生干擾。

表6 靈芝總三萜母液中總三萜濃度

2.2 靜態吸附-解吸實驗

根據計算公式得出8種大孔吸附樹脂吸附率和解吸率。結果表明，HPD400大孔吸附樹脂的吸附率（67.27%）和解吸率（97.5%）均較高（圖1），因此，綜合考慮，選擇其用于靈芝總三萜的富集工作。

圖1 不同型號大孔吸附樹脂對靈芝總三萜的靜態吸附-解吸率（n=3）

3 討論

靈芝是一種既可作為食物又可作為藥物使用的物質。近年來，大孔吸附樹脂已有用于靈芝三萜類物質分離純化工作。選擇合適的樹脂是開展利用大孔吸附樹脂純化靈芝三萜研究工作的基礎。錢竹等[9]用大孔樹脂從發酵液中分離提取靈芝三萜類物質，并比較了4種大孔吸附樹脂AB-8、S-8、NKA-9和HP-20。結果發現，AB-8樹脂最適合于靈芝三萜的分離和純化。段曉穎等[10]通過乙醇回流提取靈芝子實體中的靈芝總三萜成分，再利用大孔吸附樹脂富集，實驗比較了HPD100、HPD300、HPD400、HPD600、D101、AB-8、X-5、HPD-BJQH和S-8這9種大孔吸附樹脂對靈芝總三萜的富集效果，結果選擇HPD400來富集靈芝總三萜。通過大孔吸附樹脂靜態吸附-解吸實驗，本實驗進一步比較了HPD400與HPD500、D101、D4020、LSA-21、DM301、HZ816、HP-20對靈芝總三萜的吸附和解吸作用，證實HPD400是較理想的大孔吸附樹脂。

大孔吸附樹脂的比表面積是影響樹脂吸附性能的重要因素[11]。與LSA-21型大孔吸附樹脂相比，在極性類型和樹脂結構相同，平均孔徑相當的情況下，比表面積更大的HZ816型樹脂顯示了更高的吸附率。但過高的比表面積，可能使HZ816型樹脂吸附更多的雜質，從而干擾靈芝三萜的解吸，結果HZ816型樹脂的解吸率反而明顯低于LSA-21型樹脂。因此，合適的大孔吸附樹脂比表面積是純化靈芝總三萜的關鍵因素之一。樹脂的孔徑和極性等也是影響樹脂吸附性能的重要因素，這些因素最終影響到大孔樹脂對所純化物質的吸附率和解吸率。通過比較這些樹脂對靈芝三萜的吸附率和解吸率，鑒于HPD400大孔吸附樹脂同時具有較高的吸附率和解吸率，因此最終選擇其用于后續靈芝總三萜的富集純化工作。