川牛膝對淡水石斑魚部分血清抗氧化指標的影響

孫曉旺，鄭艷坤，馬 林，李明澤，尤宏爭，畢相東，孫學亮*

（ 1. 天津市水產研究所，天津 300221 ；2. 天津市農業發展服務中心，天津 300161 ； 3. 天津農學院，天津 300192 ）

淡水石斑魚（Cichlasoma managuense）屬于脊索動物門、脊椎動物亞門、硬骨魚綱、輻鰭亞綱，別稱石斑魚。淡水石斑魚原產自中美洲尼加拉瓜，廣東、江西等養殖單位引入后進行推廣養殖[1]。淡水石斑魚具有生長速度快、耐低氧、抗病力強等特點，不僅肉質鮮美、營養豐富，而且外形美觀、體態優美，既可以作為商品魚食用，還可以作為觀賞魚，是一種值得推廣的淡水優良品種[2]。近年來，國內外學者對淡水石斑魚的養殖技術愈發重視，淡水石斑魚的養殖規模也越來越大，逐漸成為淡水養殖中的重要品種[1-3]。

川牛膝（Radix cyathulae）屬于植物界、被子植物門、雙子葉植物綱、莧科，別稱白牛膝、拐牛膝、肉牛膝，為莧科植物川牛膝的干燥根[4]。采集時需秋、冬二季采挖，除去蘆頭、須根及泥沙，烘或曬至半干，堆放回潤，再烘干或曬干[5]。其味甘、微苦，性平，具有逐瘀通經，通利關節、利尿通淋等功效[5]。川牛膝用于治療經閉癥瘕、胞衣不下、跌撲損傷、風濕痹痛、足痿筋攣、尿血血淋等[5]。張鈺芹等[6]研究發現，牛膝多糖還可通過調控腫瘤的微環境，改善機體的血液流變性，起到抑制腫瘤細胞生長的作用。

目前，國內外學者對淡水石斑魚的研究主要集中在養殖繁育、肌肉營養等方面，川牛膝作為添加劑對淡水石斑魚的體內抗氧化性的相關研究尚未見報道。本研究使用中草藥川牛膝添作為飼料添加劑飼養淡水石斑魚，旨在研究和評價川牛膝對淡水石斑魚體內抗氧化性的影響，為淡水石斑魚的健康養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用450 尾淡水石斑魚，購自天津市七里海水產養殖場。平均體長（15.20±1.20） cm、體質量（50.20±2.30） g，隨機分為5組，每組3個重復，每個重復30尾魚，飼養于15 個長38 cm×寬26 cm×高36 cm 的水族箱中。水溫為（37.0±0.5） ℃，pH 值7.24，溶氧為6.0～6.2 mg/L。飼料選用福州海馬牌石斑魚商品飼料（Q/FZHM 005），飼料營養水平見表1，每日投喂飼料量約為魚體重的1%。試驗用川牛膝購自天津市中草藥店，選取川牛膝植物根莖，使用研磨機械充分研磨成粉狀。

表1 試驗飼料營養水平Tab.1 Nutrient levels of the experimental diets 單位：%

1.2 試驗設計及飼養管理

試驗設置5 個濃度梯度，在基礎飼料中分別添加0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的川牛膝（包括1個對照組和4個濃度梯度試驗組），每組設3個重復。試驗期間，每天9：00和15：00分別對應投喂含不同川牛膝濃度的飼料，每日投喂飼料量約為魚體重的1%。每日密切觀察受試淡水石斑魚的狀態，若發現魚體死亡，則及時撈出，稱重，記錄。

1.3 測定指標及方法

分別在試驗開始第7、第14、第21 和第28 d 對試驗魚進行采樣，每個水族箱中每次取5條受試淡水石斑魚。使用2 mL注射器從受試淡水石斑魚的尾柄處插入受試魚體的動脈中采集血液，注入已標記好的離心管中，離心管中事先加入適量肝素，防止血液凝固，將已標記好的離心管放入冰水中，避免無關因素對試驗造成影響。取完同一水箱的魚血液樣品，4 ℃冰箱內保存，并在1 d內對血液進行離心處理（4 ℃、4 000 r/min 離心10 min）。使用南京建成生物科技有限公司試劑盒對各血清樣品測定抗氧化指標，包括谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、超氧化物歧化酶（CAT）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 軟件對數據進行初步整理與統計，SPSS 19.0 統計軟件進行方差分析，Duncan's 法進行多重比較。結果以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 川牛膝對淡水石斑魚血清GSH-Px 活性的影響（見表2）

表2 川牛膝對淡水石斑魚血清GSH-Px活性的影響Tab.2 Effect of Radix cyathulae on the serum GSH-Px activity of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表2 可知，試驗第14 d 時，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px活性顯著高于對照組、1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗第7 d和21 d時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于0.5%川牛膝添加組和1.5%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗28 d時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px活性顯著高于對照組（P＜0.05），但與其余各濃度組相比差異不顯著（P＞0.05）。

對照組淡水石斑魚在試驗第7、第21 d 時淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于試驗第14、第28 d（P＜0.05）；2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第21 d 時的血清GSH-Px活性顯著高于試驗第14、第28 d（P＜0.05）。

2.2 川牛膝對淡水石斑魚血清SOD活性的影響（見表3）

由表3 可知，試驗第7 d 時，對照組淡水石斑魚血清SOD 活性顯著高于1.0%川牛膝添加組、1.5%川牛膝添加組、2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗第14、第21 d 時，1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清SOD活性顯著高于對照組（P＜0.05）；試驗第28 d 時，對照組淡水石斑魚血清SOD 活性顯著低于各試驗組（P＜0.05）。對照組淡水石斑魚試驗第7 d 時的血清SOD 活性顯著高于試驗第28 d（P＜0.05）；1.0%川牛膝添加組、1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第14 d 時的血清SOD 活性顯著高于試驗第21 d時（P＜0.05）；且1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第14 d時的血清SOD活性最高（P＜0.05）。

2.3 川牛膝對淡水石斑魚血清CAT活性的影響（見表4）

表4 川牛膝對淡水石斑魚血清CAT活性的影響Tab.4 Effect of Radix cyathulae on the serum CAT activity of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表4可知，試驗第7 d時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清CAT活性顯著高于對照組和1.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗第14 d 時，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清CAT 活性顯著高于2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗第21、28 d 時，1.5%川牛膝添加組CAT 活性顯著高于2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）。0.5%川牛膝添加組各時間點淡水石斑魚的CAT 活性差異不顯著（P＞0.05）；1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第28 d 時的血清CAT 活性顯著高于其他時間點（P＜0.05）；1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第21 d 時的血清CAT 活性顯著高于試驗第7 和第14 d（P＜0.05）；2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第7 d時的血清CAT活性最高，顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.4 川牛膝對淡水石斑魚血清MDA含量的影響（見表5）

表5 川牛膝對淡水石斑魚血清MDA含量的影響Tab.5 Effect of Radix cyathulae on the serum MDA concentration of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表5可知，對照組淡水石斑魚在試驗第7 d時的血清MDA 含量顯著高于其他時間點（P＜0.05），且顯著高于1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）。試驗第14 d 時，1.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清MDA 含量顯著高于試驗第7 d 時（P＜0.05）。試驗第21 d 時，0.5%川牛膝添加組和1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清MDA 含量顯著低于試驗第28 d 時（P＜0.05）。試驗第28 d 時，0.5%川牛膝添加組、1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清MDA 含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.5 川牛膝對淡水石斑魚血清T-AOC的影響（見表6）

表6 川牛膝對淡水石斑魚血清T-AOC的影響Tab.6 Effect of Radix cyathulae on the serum T-AOC of the Cichlasoma managuense 單位：U/mL

由表6可知，試驗第7 d時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC 顯著高于其他組（P＜0.05）；試驗第14 d時，0.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC顯著高于對照組、1.0%川牛膝添加組和1.5%川牛膝添加組（P＜0.05）；試驗第21 d 時，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC 顯著高于對照組（P＜0.05）；試驗第28 d 時，1.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清T-AOC顯著高于對照組、0.5%川牛膝添加組和2.0%川牛膝添加組（P＜0.05）。

1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚試驗第28 d 時淡水石斑魚的血清T-AOC 顯著高于試驗第7、第14 d（P＜0.05）。2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚各時間點的血清T-AOC差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 川牛膝對淡水石斑魚血清GSH-Px活性的影響

GSH-Px是機體內廣泛存在的一種活性氧自由基清除劑，與CAT和SOD共同組成了機體的抗氧化防御系統[7-8]。GSH-Px 能夠清除機體內的過氧化氫和脂質過氧化物，阻止活性氧自由基對生物體內的損傷，確保機體正常的生命活動[9]。本試驗結果表明，試驗第14 d 時，0.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px活性顯著高于對照組、1.5%和2.0%川牛膝添加組；試驗第21 d時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于0.5%、1.0%和1.5%川牛膝添加組，表明川牛膝對GSH-Px的影響在逐漸累積。試驗28 d 時，2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清GSH-Px 活性顯著高于對照組，但與其余各添加組相比差異不顯著，表明試驗第21 d 與28 d 間淡水石斑魚血清GSH-Px 活性存在一個峰值。2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚各時間點的血清GSH-Px活性存在顯著差異，其中試驗第21 d 時的血清GSH-Px 活性顯著高于試驗第14 d 和28 d。綜上所述，川牛膝添加量為2.0%時，淡水石斑魚血清GSH-Px活性在試驗第21 d時顯著高于其他時間點，在21 d 與28 d 之間到達峰值，之后下降；川牛膝濃度為0、0.5%、1.0%、1.5%時，各時間點測得的數據之間差異不顯著。結果表明，川牛膝濃度為2.0%時對淡水石斑魚血清GSH-Px活性的影響較明顯。這與唐靜[10]研究中對小鼠灌胃不同劑量的川牛膝后，T-SOD、CAT、GSH-Px 的活性和T-AOC均有不同程度的升高的試驗結果基本吻合。

3.2 川牛膝對淡水石斑魚血清SOD活性的影響

SOD 別名肝蛋白，是一種內源性抗氧化金屬酶，能夠消除生物體在新陳代謝過程中產生的自由基和活性氧，防止脂質過氧化，還具有抗衰老的特殊效果[11-13]。倪青松等[14]用含不同濃度川牛膝的飼料飼喂仔雞7 d，發現川牛膝多糖可通過提高血清抗氧化性指標水平提高機體的免疫能力。本試驗中，對照組淡水石斑魚血清SOD活性隨時間推移逐漸降低，試驗第28 d 時活性顯著低于第7 d 時。通過飼料中加入川牛膝，試驗第28 d 時，各添加組淡水石斑魚血清SOD活性均顯著高于對照組；其中，1.0%、1.5%、2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚血清SOD活性的峰值均出現在試驗第14 d，之后出現不同程度的下降，在試驗第28 d時略有回升。與1.0%、2.0%川牛膝添加組相比，1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清SOD活性除在試驗第7 d時略低外，在其余各時間點均為最高。綜上所述，川牛膝對淡水石斑魚血清SOD的作用效果在試驗第14 d時最為明顯，且川牛膝添加濃度為1.5%時效果最佳。這與玄一凡等[13]得出的在虹鱒飼料中添加2%復方中草藥能夠增強虹鱒幼魚血清SOD活性的研究結果相似，表明飼料中適量添加中草藥能夠提升魚類的抗氧化性能，但過量添加反而會降低魚類抗氧化性，對魚體產生不良影響。

3.3 川牛膝對淡水石斑魚血清CAT活性的影響

CAT 是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結合酶[15]。CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一[15-16]。羅李媛等[17]從川牛膝中提取川牛膝多糖，測定并證實其參與了機體的細胞免疫和體液免疫，從而提高機體的免疫力；川牛膝還具有促進動物體生長發育的功能。本試驗中，試驗第21 d 時，1.5%川牛膝添加組淡水石斑魚血清CAT活性顯著高于試驗第7、第14 d，說明在添加濃度為1.5%，川牛膝對淡水石斑魚血清CAT活性具有明顯的增強效果；試驗第28 d時，2.0%川牛膝添加組CAT活性顯著低于其余各組，說明淡水石斑魚血清CAT 活性在試驗第21 d 和第28 d 之間存在一個最低值。根據這一特性，在生產中可根據實際需求適當調節川牛膝的添加濃度。綜上所述，CAT對川牛膝的刺激反應非常靈敏，但注意在實際生產中不宜持續性地使用川牛膝增強淡水石斑魚的CAT活性。

3.4 川牛膝對淡水石斑魚血清MDA含量的影響分

MDA 由乙醛和甲酸乙酯在堿作用下縮合而得，可在高真空下升華精制，主要用于醫藥中間體或感光色素的原料[18]。在生物體內，自由基作用于脂質發生過氧化反應，氧化終產物為MDA，會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，且具有細胞毒性，更具有潛在的致癌性[18-19]。由于動物肉品變質主要是由于脂類物質的氧化，而MDA作為脂類物質的氧化產物，其含量可間接反映動物脂類氧化的程度[20]。本試驗結果顯示，受試淡水石斑魚血清MDA 含量對于川牛膝的刺激在低濃度時（如0.5%、1.0%）反應較遲緩，在試驗第21 d時，川牛膝才開始對MDA指標產生影響。川牛膝添加濃度為1.5%和2.0%時，淡水石斑魚血清MDA含量在試驗第7 d和第14 d時存在顯著差異。因此，在一定的范圍內，隨著川牛膝添加濃度升高可增加魚血清MDA 的含量。試驗第21 d 時，飼料中添加低濃度的川牛膝（如0.5%、1.0%），淡水石斑魚血清MDA 含量顯著低于對照組和其他添加組，表明較低濃度的川牛膝可在試驗第21 d 時降低淡水石斑魚血清MDA 含量，降低魚體內脂類的氧化程度。

3.5 川牛膝對淡水石斑魚血清T-AOC的影響

T-AOC 能夠反映魚體抗氧化能力的總體表現，是機體防御體系中酶促及非酶促中各因子抗氧化能力的總和，可較為全面地體現魚體抗氧化酶系統和非酶促系統對外界不良因素刺激的代償能力[19]。王麗新[21]通過觀察黃芪提取液對自然衰老小鼠皮膚中T-AOC、ATP 酶活性的影響及小鼠皮膚組織結構在用藥前后的變化，證明了黃芪提取液在延緩小鼠皮膚自然衰老方面的作用。本試驗中，除2.0%川牛膝添加組淡水石斑魚各時間點的血清T-AOC不存在顯著差異外，其余各濃度組之間均存在顯著差異；飼料中川牛膝添加濃度為1.0%時，試驗第28 d時，淡水石斑魚血清T-AOC 最高。綜合而言，川牛膝對淡水石斑魚血清T-AOC的影響效果呈波浪形。唐靜[10]給小鼠灌胃不同劑量川牛膝多糖，發現小鼠體內的T-SOD、CAT、GSH-Px的活性和T-AOC 均有不同程度的升高，這與本試驗結果基本吻合。

4 結論

不同濃度的川牛膝作為飼料添加劑能夠對淡水石斑魚血清抗氧化指標產生影響。在各添加濃度下，川牛膝對淡水石斑魚血清GSH-Px、CAT活性在試驗第21 d時的影響效果最明顯，而SOD 活性、MDA 含量與T-AOC 在試驗28 d時達到最大值。研究表明，川牛膝對淡水石斑魚的抗氧化功能具有促進作用，但每項抗氧化指標的最適濃度不同；為提高其血清GSH-Px、CAT、SOD 的活性和T-AOC，降低MDA 含量，在養殖過程中可預先添加0.5%川牛膝，再根據實際情況適量增加川牛膝的添加濃度，以達到最優的養殖效果。