不同核數的靈芝菌絲體轉錄組比較分析

王紅麗 楊揚 胡學博

摘要：以野生靈芝［Ganoderma lucidum （Leyss. ex Fr.） Karst.］（D）、自然單核靈芝（Mo）、雙核靈芝（Mu）的菌絲體為材料，利用高通量測序技術篩選差異表達基因，并進行GO分析和KEGG富集分析。通過差異基因分析，篩選出568個差異表達基因。GO分析結果表明，野生靈芝（D）與自然單核靈芝（Mo）菌絲體的差異表達基因主要富集在轉錄調控及DNA模板化、tRNA氨酰化、組蛋白甲基化等過程；野生靈芝（D）與雙核靈芝（Mu）菌絲體的差異表達基因主要富集在染色質沉默、L-絲氨酸代謝、硫化合物代謝等過程；自然單核靈芝（Mo）與雙核靈芝（Mu）菌絲體的差異表達基因主要富集在染色質沉默、DNA模板轉錄、谷氨酸分解等過程。KEGG富集結果表明，自然單核靈芝（Mo）與雙核靈芝（Mu）菌絲體在代謝通路上有明顯的差異，差異基因主要被注釋到過氧化物酶、維生素代謝等通路。野生靈芝（D）與自然單核靈芝（Mo）菌絲體、野生靈芝（D）與雙核靈芝（Mu）菌絲體的差異基因并沒有KEGG富集的結果，說明其代謝通路沒有明顯差異。篩選出3個品系中表達量差異均顯著的基因，共12個，并對基因的主要功能進行預測。12個基因中有5個基因可以匹配到GO庫。GO注釋結果表明，這5個基因主要被注釋到氧化還原酶活性、金屬離子結合、膜的調控與膜組成等方面。

關鍵詞：靈芝［Ganoderma lucidum （Leyss. ex Fr.） Karst.］；轉錄組；菌絲體核數

中圖分類號：S567.3? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）12-0200-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.035 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Comparative analysis of transcriptome of Ganoderma lucidum mycelium with different nuclear numbers

WANG Hong-li， YANG Yang， HU Xue-bo

（College of Plant Science and Technology/Institute of Medicinal Plants/Innovation China & the Belt and Road International Institute for Industrial Science and Technology Innovation of Traditional Chinese Medicinal Materials/National and Local Joint Engineering Research Center for Medicinal Plant Breeding and Cultivation/Hubei Engineering Research Center for Medicinal Plants， Huazhong Agricultural University，Wuhan? 430070， China）

Abstract： Using the mycelium of wild Ganoderma lucidum ［Ganoderma lucidum （Leyss. ex Fr.） Karst.］（D）， natural mononuclear Ganoderma lucidum （Mo）， and binuclear Ganoderma lucidum （Mu） as materials， high-throughput sequencing technology was used to screen differentially expressed genes， and GO analysis and KEGG enrichment analysis were conducted. Through differential gene analysis， 568 differentially expressed genes were screened. The GO analysis results showed that the differentially expressed genes between wild Ganoderma lucidum （D） and natural mononuclear Ganoderma lucidum （Mo） hyphae were mainly enriched in transcriptional regulation， DNA templating， tRNA aminoacylation， and histone methylation processes；the differentially expressed genes in the mycelium of wild Ganoderma lucidum （D） and binuclear Ganoderma lucidum （Mu） were mainly enriched in processes such as chromatin silencing， L-serine metabolism， and sulfur compound metabolism；the differentially expressed genes in the mycelium of natural mononuclear Ganoderma lucidum （Mo） and binuclear Ganoderma lucidum （Mu） were mainly enriched in processes such as chromatin silencing， DNA template transcription， and glutamate decomposition. The KEGG enrichment results indicated that there were significant differences in the metabolic pathways between natural mononuclear Ganoderma lucidum （Mo） and binuclear Ganoderma lucidum （Mu） mycelium， with differential genes mainly annotated into pathways such as peroxidase and vitamin metabolism.The differential genes between wild Ganoderma lucidum （D） and natural mononuclear Ganoderma lucidum （Mo） mycelium， as well as between wild Ganoderma lucidum （D） and binuclear Ganoderma lucidum （Mu） mycelium， did not show KEGG enrichment， indicating no significant differences in their metabolic pathways. A total of 12 genes with significant differences in expression levels were selected from 3 strains， and the main functions of the genes were predicted.Out of 12 genes， 5 genes could be matched to the GO library. The GO annotation results indicated that these 5 genes were mainly annotated in aspects such as oxidoreductase activity， metal ion binding， membrane regulation， and membrane composition.

Key words： Ganoderma lucidum ［Ganoderma lucidum （Leyss. ex Fr.） Karst.］； transcriptome； mycelial nucleus number

靈芝是多孔菌科真菌靈芝［Ganoderma lucidum （Leyss. ex Fr.） Karst.］的子實體，隸屬于擔子菌亞門傘菌綱多孔菌目多孔菌科靈芝屬［1］。靈芝在中國用藥歷史悠久，是一種典型的藥食兩用真菌［2］。研究發現，多糖和靈芝酸是靈芝的主要功能代謝物，具有抗氧化和抗炎功能［3-6］。研究人員從靈芝菌絲體中分離得到了多種生物活性成分，主要包括多糖、三萜、蛋白質、甾醇等。隨著對靈芝活性成分研究的不斷深入，其藥用價值也不斷被發現。已有研究發現靈芝中所含的活性成分具有多種功效，其中包括抗腫瘤、抗炎、抗衰老、免疫調節、調節血壓、保護肝功能、治療皮膚病以及降血糖等作用［7-10］。

葉麗云等［11］在靈芝單、雙核菌絲體差異研究的試驗中發現雙核菌株三萜含量顯著高于單核菌株，且熒光定量PCR結果顯示雙核菌株的6個三萜關鍵酶的表達量顯著高于單核菌株，表明基因表達可能存在協調增效作用。連瑞麗等［12］在靈芝單、雙核菌絲體液體發酵產多糖量的比較研究中發現單核菌絲體的多糖產量高于雙核菌絲體。

多倍體育種是微生物中常用的一種育種方式［13］。在野生靈芝（D）的基礎上，通過培養皿原生質體分離獲得了自然單核靈芝（Mo），通過秋水仙堿誘變獲得了雙核靈芝（Mu）。轉錄組是基因組遺傳信息與蛋白質組各種生物功能之間連接的重要紐帶，可以通過分析轉錄本的結構和表達水平在基因表達的層面上對生物體調控機制等進行研究，從而揭示生物體的基因表達、研究結構的變異及發現新基因等［14，15］。本研究對野生靈芝（D）、自然單核靈芝（Mo）、雙核靈芝（Mu）3個菌株進行了RNA-Seq高通量測序，再通過生物信息學方法分析，找出了3個不同靈芝品系之間的差異基因。通過不同品系靈芝兩兩之間的轉錄組比較分析，找出表達量差異顯著的基因，并對其基因功能進行注釋，預測其可能的功能，為相關代謝組的比對和功能驗證提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 野生靈芝（D）、自然單核靈芝（Mo）、雙核靈芝（Mu）均來自華中農業大學植物科學技術學院藥用植物研究所。D、Mo、Mu 3個菌株均測3次RNA，分別記為D1、D2、D3、Mo1、Mo2、Mo3、Mu1、Mu2、Mu3。

1.1.2 儀器 Master-R型超純水機（上海和泰儀器有限公司），ZQWY-200型振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司），SPX-150BIII型生化培養箱（天津泰斯特儀器有限公司），電熱恒溫培養箱（金壇市易晨儀器制造有限公司），JY6002型電子天平（上海舜宇恒科學儀器有限公司），DYY2C型電泳儀（北京六一儀器廠），DL-5M型低溫離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司），NanoDrop 2000型分光光度計［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］。

1.1.3 試劑 葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、酵母粉（英國OXOID公司）；七水合硫酸鎂、異丙醇（分析純，上海國藥集團化學試劑公司）；75%乙醇、氯仿。

1.2 方法

靈芝菌絲體的培養方法參照文獻［16］。將培養好的靈芝菌絲體接種在PDA培養基上，25 ℃搖床暗培養3～4 d。

1.3 RNA提取與高通量測序

取100 mL靈芝發酵液，采用TRIzol法提取RNA。檢測合格的樣品采用 Illumina HiseqTM 2500 進行高通量測序，原始數據過濾除雜。

1.4 數據分析

使用DESeq2軟件（http：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）篩選差異基因，篩選條件為Padj<0.05且|log2（FC）|>1。

采用Fastqc（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）對RNA原始測序數據進行快速評估，分析其接頭片段。并進一步用Trimmomatic（https：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Trimmomatic.html）過濾接頭片段。采用Gfold（https：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Gfold.htm）分析基因定量表達和篩選基因表達差異。采用Hisat2（https：//bioconductor.org/packages/release /bioc/html/Hisat2.htm）將參考基因組與轉錄組進行比對。TBtools用于GO富集分析。使用BLAST軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=PRJNA71455）進行相似性檢索。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計與處理

2.1.1 原始測序數據分析 本研究獲得高通量RNA測序的原始數據，每個樣品數值較接近，表明重復性較好。測序結果中每個樣品都有接頭，并且每個接頭片段均無差異，后續分析過程中對原始數據進行處理，去除低質量堿基或未能識別的堿基。

使用Fastqc軟件對測試數據進行質量分析，再使用multiQC軟件對所有結果進行組合。利用Trimmomatic軟件對原始數據進行去雜處理，并對堿基進行合適的修改，得到的reads質量統計結果如表1所示，樣品總體質量較好，僅有少數片段（<0.3%）是低質量堿基序列，表明可以對數據進行進一步研究。

2.1.2 測序結果預處理 將過濾處理后的序列與靈芝參考基因組進行比對，結果如表2所示，D、Mo、Mu基因組與靈芝參考基因組的比對率為84.06%～86.65%。并且轉錄組序列比對到參考基因組的唯一比對數較多，唯一比對率也較高，為64.07%～66.82%。

利用Gfold軟件對樣品進行count計數，并且利用R包對其進行相關性分析，結果如圖1所示，每個樣品的相似度均超過0.93，證明原始數據可靠，可以運用該數據進行后續的基因差異分析以及功能富集分析。

2.2 基因差異性表達分析

通過R包上的DESeq2軟件進行基因的差異分析，統計樣品間的差異基因，由圖2可知，野生靈芝（D）菌絲體與自然單核靈芝（Mo）菌絲體差異基因比較中上調基因有110個，下調基因有67個；野生靈芝（D）菌絲體與雙核靈芝（Mu）菌絲體差異基因比較中上調基因有117個，下調基因有89個；自然單核靈芝（Mo）菌絲體與雙核靈芝（Mu）菌絲體差異基因比較中上調基因有86個，下調基因有99個。利用Excel軟件進行差異基因的比較，并對基因以FPKM進行表達豐度檢測（表3），對所有基因在野生靈芝（D）、自然單核靈芝（Mo）、雙核靈芝（Mu）菌絲體中的表達進行差異顯著性分析，篩選出靈芝菌絲體中共有的差異基因，分別為GL23181-R1，GL15298-R1，GL15297-R1，GL20735-R1，GL17872-R1，GL17848-R1， GL17191-R1，GL28818-R1，GL19837- R1，GL23330-R1，GL18253-R1，GL15569-R1。

2.3 差異表達基因的GO分析

根據基因組序列進行GO注釋，使用EggNOG功能注釋數據庫，得到注釋結果后利用TBtools軟件進行GO富集分析，結果如圖3所示。

野生靈芝（D）菌絲體與自然單核靈芝（Mo）菌絲體的基因功能主要富集到轉錄調控及DNA模板化（Regulation of transcription，DNA-templated）、tRNA氨酰化（Lysyl tRNA aminoacylation）、氧化還原過程（Oxidation-reduction process）、發病機理（Pathogenesis）、硫氨基酸代謝過程（Sulfur amino acid metabolic process）、組蛋白甲基化（Histone H3-K36 methylation）等過程，且發病機理（Pathogenesis）較顯著，富集到轉錄調控及DNA模板化（Regulation of transcription，DNA-templated）和氧化還原過程（Oxidation-reduction process）中的基因數目較少。野生靈芝（D）菌絲體與雙核靈芝（Mu）菌絲體的基因功能主要富集到染色質沉默（Chromatin silencing）、L-絲氨酸代謝過程（L-serine metabolic process）、蛋白脫乙酰作用（Protein deacetylation）、蛋白質在核糖體的合成（Protein import into peroxisome matrix）、硫化合物代謝（Sulfur compound metabolic process）過程，且富集結果顯著。自然單核靈芝（Mo）菌絲體與雙核靈芝（Mu）菌絲體的基因功能主要富集到染色質沉默（Chromatin silencing）、DNA模板轉錄（DNA-templated transcription，elongation）、谷氨酸分解（Glutamate catabolic process to 2-oxoglutarate）、組蛋白甲基化（Histone H3-K36 methylation）、L-絲氨酸代謝過程（L-serine metabolic process）、發病機理（Pathogenesis）、蛋白脫乙酰作用（Protein deacetylation），且發病機理（Pathogenesis）較顯著。根據野生靈芝（D）、自然單核靈芝（Mo）、雙核靈芝（Mu）菌絲體的基因功能富集結果可以看出，靈芝菌絲體經過染色體加倍之后，富集的通路數有所減少，但各通路的顯著程度較高。

2.4 差異表達基因的KEGG富集分析

經KEGG注釋之后，利用TBtools工具進行KEGG富集分析。由圖4可知，自然單核靈芝（Mo）菌絲體與雙核靈芝（Mu）菌絲體在代謝通路上有明顯的差異，差異基因主要被注釋到過氧化物酶（Peroxisome）、維生素代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）、代謝（Metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、染色體及相關蛋白（Chromosome and associated proteins）通路中。野生靈芝（D）菌絲體與自然單核靈芝（Mo）菌絲體、野生靈芝（D）菌絲體與單核加倍得到的雙核靈芝（Mu）菌絲體的差異基因并沒有KEGG富集的結果，表明野生靈芝（D）菌絲體和單核靈芝（Mo）菌絲體以及雙核靈芝（Mu）菌絲體之間代謝通路無明顯差異。

2.5 差異基因主要功能預測

通過基因差異性表達分析篩選出了12個基因，利用BLAST2GO軟件對差異基因進行生物大分子序列比對分析，從而找出12個差異基因主要的生理功能及作用。序列對比分析結果如表4所示，12個差異基因均能通過生物大分子序列比對（BLAST）匹配到蛋白質數據庫（Nr）。根據Nr注釋結果可以看出12個基因中，某些基因可能與細胞色素P450（Cytochrome P450）、真菌疏水蛋白（Fungal hydrophobin）、WD40重復樣蛋白（WD40 repeat-like protein）相關，但也有一些基因可能與功能未知的蛋白質有關。

利用Blast2GO軟件將12個基因的Nr注釋結果轉換為GO注釋，結果如表5所示。發現在12個基因中有5個基因可以匹配到GO庫，分別為GL23181- R1、GL15297-R1、GL15298-R1、GL17191-R1和GL18253-R1。根據GO注釋結果可以看出，5個基因的主要功能是氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity）、金屬離子結合（Metal ion binding）、細胞壁成分（Structural constituent of cell wall）、細胞外區域（Extracellular region）、真菌性細胞壁（Fungal-type cell wall）、轉錄調控及DNA模板化（Regulation of transcription， DNA-templated）、膜（Membrane）、膜的調控與膜組成（Integral component of membrane）。并且金屬離子結合在基因GL23181-R1、GL17191-R1中均存在；細胞壁成分（Structural constituent of cell wall）、細胞外區域（Extracellular region）、真菌性細胞壁（Fungal-type cell wall）在基因GL15297-R1、GL15298-R1中均存在，表明與靈芝菌絲體核數有關的基因可能功能是調控細胞壁的組分，調控與金屬離子結合等。

3 小結與展望

本研究利用轉錄組測序技術，分析了不同核數靈芝的基因表達變化。對野生靈芝（D）、自然單核靈芝（Mo）、雙核靈芝（Mu）的菌絲體進行了RNA高通量測序，并對基因進行了差異分析。篩選出了12個差異顯著的基因，分別為GL23181-R1，GL15298-R1，GL15297-R1，GL20735-R1，GL17872-R1，GL17848-R1，GL17191-R1，GL28818-R1，GL19837- R1，GL23330-R1，GL18253-R1，GL15569-R1。Nr注釋結果表明，在12個基因中某些基因可能與細胞色素P450（Cytochrome P450）、真菌疏水蛋白（Fungal hydrophobin）、WD40重復樣蛋白（WD40 repeat-like protein）相關，但也有一些基因可能與功能未知的蛋白質有關。GO注釋結果表明，差異基因的主要功能是氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity）、金屬離子結合（Metal ion binding）、細胞壁成分（Structural constituent of cell wall）、細胞外區域（Extracellular region）、真菌性細胞壁（Fungal-type cell wall）、轉錄調控及DNA模板化（Regulation of transcription， DNA-templated）、膜（Membrane）、膜的調控與膜組成（Integral component of membrane）。

單核靈芝菌絲體與雙核靈芝菌絲體的差異研究發現，雙核靈芝菌絲體的三萜含量高于單核靈芝菌絲體，多糖含量低于單核靈芝菌絲體［6］。對不同核數靈芝菌絲體進行轉錄組差異分析，在野生靈芝（D）、自然單核靈芝（Mo）、雙核靈芝（Mu）菌絲體的差異基因中，篩選出12個表達量均差異顯著的基因，并對其生物學功能［17-19］進行預測。后續可對相應的代謝組與轉錄組分析結果進行整體分析和驗證，從分子水平驗證基因的功能，明確控制靈芝菌絲體核數的主要基因［20］。未來可在該基因的基礎上，創制突變體，將其應用于靈芝種植，以降低成本，指導生產，提高靈芝的經濟價值。

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