桑色素通過抑制MMP9表達改善慢性阻塞性肺疾病

冷安明,楊 靜,張 葵

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種因氣流受限導致的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,其發(fā)病機制尚未完全明確,吸煙或由于有害氣體等刺激氣道引起的炎性反應和氧化應激等被認為是導致該病的重要原因[1]。治療COPD最重要的是改善肺功能,目前針對COPD的主要治療手段包括肺康復訓練、抗菌藥物、糖皮質激素的使用、吸入支氣管擴張劑等,然而一些藥物的不良反應限制了COPD的治療[2]。

桑色素屬于黃酮類化合物,化學式為C15H10O7(圖1),主要存在于桑葉等植物中,研究[3]表明其具有抗炎、抗氧化等作用。另外也有研究[4-5]顯示其在脂多糖誘導的急性肺損傷、膿毒癥肺損傷中均發(fā)揮保護作用。但是其在COPD中的作用仍有待進一步研究。網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學的研究方法,融合了復雜網(wǎng)絡、統(tǒng)計學等手段,有利于在分子水平探究藥物的作用機制、加強藥物基因靶點和生物標志物的開發(fā)[6]。該研究旨在從網(wǎng)絡藥理學角度出發(fā),分析桑色素治療COPD的潛在基因靶點并且利用動物、細胞模型驗證桑色素在COPD中的保護作用和潛在機制。

圖1 桑色素化學結構圖

1 材料與方法

1.1 試劑、材料與儀器20只雄性SPF級SD大鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2022-0002],體質量(200±20)g,周齡6～7周,將大鼠培養(yǎng)于23 ℃±2 ℃的環(huán)境中,濕度50%左右,每天光照12 h,自由攝食和飲水;香煙購自英國哈德門公司(每只含1 mg尼古丁、12 mg一氧化碳以及10 mg焦油);桑色素(貨號:480-16-0)購自美國Sigma公司;肺炎克雷伯桿菌(貨號:LA9000)和PBS溶液(貨號:P1022)購自北京索萊寶科技有限公司;TRIzol試劑盒(貨號:abs9331)以及Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號:abs50001)購自愛必信(上海)生物科技有限公司;逆轉錄試劑盒(貨號:LM-63826)購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;SYBR?PreMix Ex TaqTM試劑盒(貨號:RR820A)購自日本Takara公司;MMP9(貨號:ab228402)、GAPDH(貨號:ab181602)以及IgG(貨號:ab302644)抗體均購自英國Abcam公司;白細胞介素6(Interleukin-6, IL-6)試劑盒(貨號:ml064292)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)試劑盒(貨號:ml002859)均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基(貨號:PM150210B)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;Lipofectamine 3000試劑盒(貨號:L3000-001)購自上海金畔生物科技有限公司;RIPA裂解液(貨號:P0013B)、BCA試劑盒(貨號:P0012S)以及MTT試劑盒(貨號:C00009)購自上海碧云天生物技術有限公司;酶標儀(型號:SpectraMax M5e)購自美谷分子儀器(上海)有限公司;流式細胞儀(型號:CytoFLEX)購自美國貝克曼庫爾特公司;動物呼吸機(型號:RSE3020)購自北京貝蘭博科技公司;顯微鏡(型號:DM1000)購自德國徠卡公司。

1.2 方法

1.2.1化學成分與基因靶點的搜集 將桑色素名稱導入pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲得成分簡化分子線性輸入系統(tǒng)(simplified molecular input line entry system, SMILES)號及其化學結構式,將所得到的結構式導入到SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)數(shù)據(jù)庫預測桑色素的基因靶點。

1.2.2“成分-基因靶點”網(wǎng)絡分析 準備化合物基因“network”文件和“Type”文件,運用Cytoscape3.8.2軟件,導入相關文件,進行網(wǎng)絡拓撲學分析,根據(jù)Degree值(基因的連接數(shù)量)調整基因靶點圖形、顏色、透明度和大小,構造“中藥成分-基因靶點”網(wǎng)絡圖。

1.2.3疾病基因靶點的預測 運用GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、DisGenet(https://www.disgenet.org)平臺獲取疾病相關基因靶點,疾病名稱取“chronic obstructive pulmonary disease”為關鍵詞搜疾病相關基因靶點。設置對象為“human”,使用“VLOOKUP”函數(shù)匹配基因名。

1.2.4共同作用基因靶點的獲取 應用Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線網(wǎng)站獲取桑色素與COPD的交集基因靶點,作為桑色素和COPD的共同作用基因靶點。

1.2.5蛋白質互作用(protein-protein intersection, PPI)網(wǎng)絡構建及網(wǎng)絡拓撲分析 通過String(https://string-db.org/)平臺,導入交集基因,設置對象為(homo sapiens)、取最高置信度0.900,隱藏游離基因節(jié)點,得到蛋白互作用關系。結果導入Cytoscape3.8.2軟件中,選擇“network analyzer”,得到網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)。然后把下載好的TSV文件導入cytoscape3.8.2軟件做PPI圖。

1.2.6KEGG富集分析 利用生物信息學開源軟件 Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)在 R 語言3.6.3內(nèi)安裝運行clusterProfiler、Stringin、DOSE和Pathview程序,對桑色素和COPD的共同作用基因靶點進行生物學過程的KEGG功能進行富集分析,并通過微生信平臺進行可視化。

1.2.7分子對接 將拓撲學參數(shù)排名靠前的大分子和小分子進行分子對接。蛋白質晶體結構由RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)或者alphafold數(shù)據(jù)庫(https://alphafold.ebi.ac.uk/)獲取(PDB編號:SRC-AF_P42574;MMP9-AF_P31749;MMP2-AF_A0A024R6R4)。對接小分子庫由TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)通過搜索中藥獲取并建立。首先,使用AutodockTools 1.5.6對蛋白質晶體結構進行去水、加氫,并進行受體結構準備工作。使用Open Babel及Autodock程序對小分子庫進行拆分等準備工作。使用Autodock程序進行對接,最終將結果導入pymol進行對接結果的可視化。

1.2.8COPD動物模型建立 購買20只SD大鼠,周齡6～7周,體質量(200±20)g。將大鼠培養(yǎng)于23 ℃±2 ℃的環(huán)境中,濕度50%左右,每天光照12 h,自由攝食和飲水。將20只大鼠隨機分為對照(Control)組、COPD組、桑色素Ⅰ(40 mg/kg)組、桑色素Ⅱ(80 mg/kg)組,每組5只。依據(jù)香煙煙霧暴露和反復細菌感染的方法構建COPD大鼠模型[7]。大鼠每天2次暴露于充滿香煙煙霧[煙霧體積(3 000±500) ml/m3]的自制熏箱中,每周6 d,持續(xù)12周,此外每天給予大鼠0.1 ml的肺炎克雷伯桿菌滴鼻,每周5 d,持續(xù)8周。桑色組大鼠每天給予不同濃度的桑色素灌胃直至建模結束。12周后行戊巴比妥鈉麻醉大鼠,檢查大鼠呼吸功能參數(shù)后處死并收集部分肺組織置于-80 ℃冰箱保存,另取部分組織迅速以4%對聚甲醛固定,石蠟包埋后切片用于后續(xù)檢測。

1.2.9大鼠呼吸功能參數(shù)檢測 麻醉大鼠并固定后,切開其頸部皮膚暴露氣管,借助動物呼吸機對各組大鼠最大肺活量(forced vital capacity, FVC)、最大呼氣流速(peak expiratory flow,PEF)以及0.1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 0.1 second, FEV0.1)等指標進行測定。

1.2.10HE染色觀察大鼠肺組織病理學變化 將組織樣本進行常規(guī)石蠟包埋并切片,之后將組織切片置于二甲苯溶液中脫蠟,無水乙醇和梯度乙醇(95%、85%、70%)浸泡并水化切片。PBS沖洗,蘇木精染色10 min,鹽酸乙醇分化,雙蒸水沖洗后行伊紅染色,梯度乙醇脫水,二甲苯浸泡,中性樹膠封片并在顯微鏡下觀察。

1.2.11qRT-PCR檢測MMP9的mRNA表達 TRIzol試劑盒完成總RNA提取,按照逆轉錄試劑盒的說明書將提取的RNA反向轉錄成互補DNA(complementary DNA,cDNA)。用SYBR?PreMix Ex TaqTM試劑盒進行mRNA定量檢測,然后用2-ΔΔCt法進行分析。GAPDH作為MMP9的內(nèi)參。

1.2.12Western blot檢測MMP9蛋白表達 RIPA裂解液裂解組織和細胞中蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度。之后行SDS-PAGE凝膠電泳并且以濕轉移法轉膜。室溫下封閉1 h后,用MMP9(1/1 000)和GAPDH(1/10 000)一抗孵育過夜。在用含有0.1% PBST的PBS洗滌3次,每次10 min,用山羊抗兔IgG(1/1 000)在37 ℃下孵育1 h。PBS沖洗,ECL顯影并對蛋白條帶進行觀察,蛋白質水平通過GAPDH標準化,利用ImageJ軟件對蛋白表達進行定量。

1.2.13香煙煙霧誘導構建COPD細胞模型 依據(jù)參考文獻[8]制備香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract, CSE)誘導的COPD細胞模型,首先將人支氣管上皮(human bronchial epithelial, HBE)細胞保存在DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中,培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2,培養(yǎng)24 h之后以濃度為4%的CSE處理HBE細胞48 h。細胞分組如下: HBE組(HBE細胞不做處理)、4% CSE組(COPD細胞模型組)、4% CSE+桑色素組(10 μmol/L、20 μmol/L或50 μmol/L的桑色素干預24 h后構建COPD細胞模型)。選取桑色素最佳干預濃度后再對細胞轉染MMP9過表達載體,轉染步驟借助Lipofectamine 3000試劑盒完成。

1.2.14MTT法檢測細胞增殖活力 取各組對數(shù)生長期細胞,每組取4×103個細胞接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,分別加入20 μl的MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h,然后小心吸棄培養(yǎng)液,每孔加入150 μl的二甲基亞砜,避光震蕩10 min,使結晶物充分溶解,用酶標儀于490 nm波長檢測各孔吸光度從而對細胞活力進行判定。

1.2.15ELISA檢測COPD細胞模型上清中炎性因子表達 取各組細胞,2 528 r/min的轉速離心10 min并取上清液。借助試劑盒對細胞上清液中IL-6和TNF-α濃度進行測定。將待測樣品以及稀釋后的標準品分別加入50 μl在反應孔中,之后加入生物素標記的50 μl抗體,37 ℃溫育1 h。之后加入80 μl親和鏈霉素-HRP,震蕩混勻。每孔加入A、B底物各50 μl,混勻并于37 ℃溫育10 min。加入50 μl終止液,借助酶標儀在450 nm處測定各孔吸光度值。

1.2.16Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒和流式細胞術測定COPD細胞模型的細胞凋亡率 在處理或轉染后收集HBE細胞,在2 528 r/min的轉速離心5 min,PBS洗滌3次并重新懸浮在結合緩沖液中,隨后行Annexin VFITC和PI雙重染色。最后,用流式細胞儀分析凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學處理采用Graphpad Prism 8.0軟件對該研究中實驗數(shù)據(jù)進行分析,計量資料以均值±標準差的形式表示,多組間比較采用單因素方差分析,多組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 桑色素和COPD的共同作用基因靶點借助SwissTargetPrediction預測桑色素的基因靶點共發(fā)現(xiàn)96個基因靶點(圖2A)。GeneCards、OMIM、DisGenet數(shù)據(jù)庫分析共得到7 122個COPD基因靶點,將COPD基因靶點與桑色素基因靶點借助Venny網(wǎng)站取交集共得到67個共同作用基因靶點(圖2B)。

圖2 桑色素治療COPD的基因靶點圖

2.2 桑色素和COPD的共同作用基因靶點的互作用分析結果String網(wǎng)站對桑色素和COPD的67個共同作用基因靶點做PPI分析,之后導入Cytoscape進行拓撲學分析。拓撲學分析結果顯示排名前5的作用較強的基因靶點包括SRC、MMP9、MMP2、PTGS2、FURIN(圖3),SRC、MMP9和MMP2連接的蛋白數(shù)目更多(表1)。

表1 核心基因靶點的拓撲學參數(shù)

圖3 PPI可視化結果

2.3 桑色素與關鍵基因靶點的分子對接將拓撲學參數(shù)排名靠前的基因靶點和桑色素進行分子對接,分子對接結合熱能<-1 kcal/mol表示具有結合活性,<-5 kcal/mol表示結合活性較好;分子對接結果顯示MMP9與桑色素的結合活性最強且形成氫鍵數(shù)目最多(表2、圖4A)。此外KEGG分析結果顯示(圖4B)MMP9在IL17以及松弛素通路中富集,而IL17和松弛素均與COPD的發(fā)病存在關聯(lián),因此本研究選擇MMP9進行后續(xù)分析。

表2 分子對接結果

圖4 分子對接結果以及KEGG分析結果可視化

2.4 桑色素改善COPD大鼠肺組織病理損傷并且對MMP9表達的影響使用動物呼吸機對各組大鼠呼吸功能參數(shù)進行檢測顯示,與Control組比較,COPD組大鼠各呼吸功能參數(shù)均明顯下降(P<0.01),而給予桑色素干預后各呼吸功能參數(shù)改善且80 mg/kg桑色素處理組改善效果更明顯(P<0.01)(表3)。對各組大鼠肺組織病理學變化進行觀察結果顯示(圖5A),Control組大鼠肺組織支氣管管腔完整,管壁形態(tài)正常且無增厚情況,肺組織淺表層未觀察到炎性細胞浸潤;COPD組大鼠肺組織支氣管管腔結構變形,管壁增厚且大量炎性細胞浸潤;加入桑色素后大鼠肺組織支氣管管腔變形改善,炎性細胞浸潤減少,提示桑色素能夠改善COPD大鼠肺組織病理損傷。進一步對各組大鼠肺組織中MMP9的mRNA和蛋白表達進行檢測顯示,相對于Control組,COPD組大鼠肺組織中MMP9的mRNA和蛋白表達明顯增加(q=17.01,P<0.01;q=17.26,P<0.01)。但與COPD組比較,加入桑色素后MMP9的mRNA(q桑色素Ⅰ組=8.03,q桑色素Ⅱ組=11.95, 均P<0.01)和蛋白(q桑色素Ⅰ組=8.47,q桑色素Ⅱ(80 mg/kg)組=13.10,均P<0.01)表達被抑制(圖5B、C)。

表3 各組大鼠呼吸功能參數(shù)(n=5)

圖5 各組大鼠肺組織病理學變化和MMP9 mRNA和蛋白表達

2.5 桑色素對CSE誘導的COPD細胞模型細胞活力與MMP9 mRNA和蛋白表達的影響使用4%CSE處理HSE細胞構建COPD細胞模型并且給予桑色素處理,MTT檢測結果顯示(圖6A)相對于HBE組,4% CSE組細胞活力明顯降低(P<0.05);而相對于4% CSE組,隨著桑色素處理濃度的增加,細胞活力也逐漸提高且50 μmol/L的桑色素對COPD細胞模型細胞活力的促進效果最佳(F=39.93,P<0.01)。進一步對各組細胞中MMP9的mRNA和蛋白表達進行檢測顯示,相對于HBE組細胞,4% CSE組的MMP9的mRNA和蛋白表達明顯上調,而相對于4%CSE組,各濃度桑色素處理組COPD細胞模型中MMP9的mRNA和蛋白表達降低(FmRNA=26.27,F蛋白=37.15,均P<0.01)(圖6B、C)。

圖6 各組細胞活力和細胞中MMP9的mRNA和蛋白表達

2.6 桑色素對CSE誘導的COPD細胞損傷的作用對各組COPD細胞模型的細胞凋亡和炎性因子表達水平進行檢測顯示,相對于HBE組,4% CSE組的細胞凋亡明顯增加,炎性因子濃度提高。在4% CSE處理的HBE細胞中加入桑色素后,COPD細胞模型的凋亡率和炎性因子濃度明顯降低。但是桑色素對COPD細胞模型凋亡和炎性反應的保護作用被MMP9過表達載體逆轉(F凋亡=79.95,FIL-6=65.68,FTNF-α=72.44,均P<0.01)。見圖7。

圖7 各組細胞凋亡率和炎性因子濃度

3 討論

近年來中藥單體在疾病治療中的作用被逐漸揭示,桑色素作為一種桑科植物中分離的中藥單體,其在抗炎、抗氧化中的作用十分顯著[9]。本研究借助網(wǎng)絡藥理學技術,從藥物成分-基因靶點-疾病出發(fā),系統(tǒng)地分析桑色素作用于COPD的潛在基因靶點和機制,并且通過動物和細胞實驗進行了驗證。

首先本研究對桑色素和COPD的共同作用基因靶點進行預測,共得到67個共同作用基因靶點,拓撲分析發(fā)現(xiàn)共同作用基因靶點中作用更強的基因包括SRC、MMP9、MMP2、PTGS2、FURIN,而SRC、MMP9、MMP2連接的蛋白數(shù)目更多。Xu et al[10]在研究中發(fā)現(xiàn)復方甘草口服液能夠通過抑制SRC/MAPK進而緩解COPD患者炎癥和氧化應激。此外,MMP2和MMP9也被證明與COPD患者肺泡隔及肺功能有關[11]。PTGS2的多態(tài)性被證明與COPD的發(fā)病風險有關[12]。上述研究在一定程度上證實了本研究預測桑色素作用于COPD的基因靶點的價值。

進一步的分子對接結果表明桑色素與MMP9存在最高的結合能,KEGG結果也顯示MMP9在IL-17通路以及松弛素通路中富集。Ding et al[13]證明IL-17在COPD急性加重期氣道感染中起著有害作用,靶向IL-17是控制COPD感染的重要策略。另外也有研究[14]證明松弛素的一種亞型,H2型松弛素在COPD進展中發(fā)揮重要作用。因此,該實驗將MMP9作為桑色素治療COPD的核心基因靶點進行研究。

該研究表明桑色素能夠改善COPD模型大鼠呼吸功能參數(shù),減少肺組織病理變化并且抑制炎性反應。Shin et al[15]研究表明桑色素能夠抑制MMP9的活性進而抑制血管平滑肌細胞的增殖并且改善動脈粥樣硬化。本研究進一步研究表明桑色素能夠顯著抑制COPD大鼠肺組織中MMP9的表達。細胞實驗中也證明了MMP9在COPD細胞模型中表達升高且桑色素能夠抑制MMP9表達。另外,該研究則通過細胞實驗證明了桑色素對COPD細胞模型炎性因子和細胞凋亡的抑制作用,且該作用可能是通過調控MMP9基因靶點實現(xiàn)。