NIPT-plus檢測技術在高危孕婦產前診斷中的應用研究

段妔 李林艷 萬雪 余江 徐敏 鄭藝 范振海 余麗梅

生育缺陷給社會與家庭帶來極大的困擾及非常沉重的經濟負擔，尤其是國家施行二孩及三孩政策放開以來，高齡孕婦明顯增多，生育風險增大。因此，人們對優生優育質量及產前篩查意識不斷增強，產前診斷受益人群隨之擴大[1-2]。如何進行有效的產前篩查，降低出生缺陷，已成為國家、社會及家庭關注的重點。現階段，擴展性無創產前基因檢測技術（noninvasive prenatal testing-plus，NIPT-plus）在高危孕婦人群產前診斷中的應用研究，是當前基于高通量測序檢測的一項產前篩查新技術，也是對孕婦母體外周血漿中的胎兒游離DNA 進行測序來檢測胎兒21- 三體、18- 三體、13- 三體染色體非整倍體異常以及亞顯微結構異常（微缺失/ 微重復）所致胎兒生長發育畸形、器官功能障礙及智力低下或殘疾等缺陷的有效手段[3-4]。它可有效篩查高危孕婦產前胎兒染色體異常疾病的風險，提高優生優育質量。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2021 年1 月—2022 年12 月就診于遵義醫科大學附屬醫院產前診斷中心的5 085 例孕婦，觀察指標包括高齡孕婦≥35 歲、 B 超提示異常信息、產前篩查血清學存在高風險。經孕婦自愿同意后接受 NIPT-plus 檢測技術，對陽性結果的孕婦采取羊水細胞穿刺術檢測，分析染色體異常因素。（1）納入標準：自然受孕、單胎、妊娠期滿13 ～24 周，明確產前篩查指征：①高危孕婦年齡；②孕婦血清學高風險篩查；③超聲影像學異常指標篩查；④孕婦不良孕產史等。（2）排除標準：非自然受孕、多胎、有傳染病史（如肝炎、結核、HIV 陽性等）、惡性腫瘤、近期有先兆流產征象或在1個月內接受過外源DNA 的免疫治療，以及孕婦在1 年內有輸血史等其他侵入性產前診斷禁忌證。（3）臨床資料的收集：①建立遺傳咨詢病例登記；②查閱遺傳咨詢孕婦的相關檢查資料；③詳細記錄高危孕婦的年齡、胎齡、孕產史、家族史、不良接觸史、產前篩查項目及超聲篩查結果等。（4）檢測流程：抽取孕婦外周血10 mL 左右，對血漿中胎兒游離DNA 進行測序，檢測13，18，21 三體及性染色體異常等指標。經遵義醫科大學附屬醫院倫理委員會批準檢測陽性樣本，父母溯源外周血染色體核型分析。

1.2 方法

1.2.1 孕婦血漿提取

EDTA 采血管采集孕婦靜脈血10 mL 左右。1 600 rpm離心10 min；小心吸取表層血漿于EP 管中，16 000 rpm 離心10 min，沉淀備用。

1.2.2 胎兒游離DNA 提取

參照QIAampDNA Blood mini kit 試劑盒說明書進行血漿DNA 提取操作。

1.2.3 NIPT-plus 檢測

在 BGISEQ-500 測序平臺采用胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒（聯合探針錨定連接測序法）進行全基因組大規模平行測序。

1.2.4 培養羊水細胞

羊膜腔穿刺術必須確保安全無菌，在B 超引導下進行操作。抽取羊水約20 mL，分別裝入2 個10 mL的無菌塑料離心管中，1 500 rpm 離心10 min。在超凈工作臺中進行去上清液操作，保留約0.5 mL 羊水；與沉淀混勻后接種于2 個細胞培養瓶內，置于5%CO2培養箱中37 ℃靜置培養7 ～10 d，觀察得到分裂中期的細胞。收獲前1 h 用秋水仙素處理，再經過低滲、固定、滴片、胰酶消化、G 顯帶等一系列實驗操作制備染色體。

1.2.5 羊水細胞染色體核型分析

正常核型：每張玻片計數核型30 個，并對其中顯帶清楚、形態良好的5 個分裂相進行分析。

異常核型：根據異常核型種類的不同，核型計數增加至50 ～100 個。核型分析數量也相應增加，有必要的情況下還需加做 N 顯帶或C 顯帶進行分析，以確定染色體結構異常及其多態性。

1.3 觀察指標

（1）NIPT-plus 結果提示染色體數目異常的高風險病例，如經羊水細胞染色體核型分析未見相應染色體數目異常，則提示NIPT-plus 結果為假陽性。

（2）NIPT-plus 結果提示染色體結構異常的高風險病例，如經羊水細胞染色體核型分析，且有必要的情況下加做特殊染色體顯帶，均未見相應染色體結構異常，則提示NIPT-plus 結果為假陽性。

（3）本研究分析異常核型均參照《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN）2020》標準進行描述[5-7]。

1.4 統計學方法

采用 SPSS 24.0 統計學軟件對數據進行分析。計數資料用n（%）表示，計量資料用（±s）表示。P＜ 0.05 為差異有統計學意義

2 結果

2.1 病例基本情況

本研究總共病例數為5 0 8 5 例，年齡3 5 ～5 0歲，平均（3 7±2）歲，其中3 5 ～4 5 歲年齡段為5 0 0 0 例，＞4 5 歲年齡段為8 5 例。納入時平均孕周（1 6.0±2.0）周。

2.2 NIPT-plus 檢測結果及陽性預測指標

共檢測5 085 例患者中，共篩出51 例高風險病例，其中8 例21- 三體、9 例18- 三體、1 例13- 三體、14 例性染色體、19 例其他染色體異常。51 例異常病例均行羊膜腔穿刺檢測結果證實有21 例確診異常，其中有7 例21- 三體（陽性87.50%）、2 例18-三體（陽性率22.22%）、8 例性染色體異常（陽性率57.14%）、其他染色體異常4 例（陽性率21.05%），見表1。

表1 NIPT-plus 對高齡孕婦產前篩查胎兒染色體異常的結果

2.3 染色體 G 顯帶核型檢測結果分析

5 085 例孕婦中，共篩出51 例異常病例，行羊膜腔穿刺術之后檢測結果證實存在21 例確診異常，見表2。其中21 例中涉及臨床常見染色體非整倍體異常13 例，分別為染色體核型是47，XN，+21 者7 例、染色體核型是47，XN，+18 者2 例，染色體核型是47，XXY者4 例，異常占比分別為0.14%、0.04%，0.08%。47，XN，+21、47，XN，+18、47，XXY 異常染色體核型見圖1 ～圖6。

圖1 箭頭標注區為原圖異常染色體

圖2 47，XN，+21

圖3 箭頭標注區為原圖異常染色體

圖4 47，XN，+18

圖5 箭頭標注區為原圖異常染色體

圖6 47，XXY

表2 13 例染色體數目異常核型結果

3 討論

隨著我國人口老齡化進程的不斷發展，為優化我國人口比例，國家先后出臺了開放二胎、三胎的生育政策。近年來，有些城市更是提出了鼓勵一對夫婦生育三胎的政策優惠措施，鼓勵適齡女性提升生育率[8-9]。因此，高齡孕產婦明顯增多，由染色體異常所導致的生育缺陷風險也隨之增多，孕前健康體檢、產前染色體疾病健康篩查顯得尤為重要。針對這些高危孕婦進行無創基因產前篩查和染色體產前診斷可有效降低生育缺陷的風險。現階段，我國通常采用新一代高通量測序技術用于孕婦外周血胎兒游離DNA 的無創產前篩查，該技術具有早期發現、無創、安全、準確、規范、便捷、快速、成本低等優勢，在臨床應用中越來越廣泛[10-11]。近年來，采用NIPTplus 對常見的21- 三體綜合征、18- 三體綜合征和13-三體綜合征的篩查準確性得到一致認同[12-13]。然而，在臨床實踐中仍舊不斷出現NIPT-plus 檢測假陰性及假陽性的結果。本研究共篩查5 085 例患者中，篩出51 例NIPT-plus 檢測高風險病例，完全涵蓋了染色體異常分類中的染色體數目異常和結構異常。當然，主要包括臨床常見的染色體非整倍體異常以及亞顯微結構的缺失或重復異常，這其中有8 例21-三體、9 例18-三體、1 例13-三體、14 例性染色體、19 例其他染色體異常；對51例NIPT-plus 檢測高風險病例均行羊水細胞染色體核型分析，結果證實存在21 例病例異常，其中有7 例21-三體異常（陽性率為87.50%）、2 例18- 三體異常（陽性率為22.22%）、8 例性染色體異常（陽性率為57.14%）、其他染色體異常4 例（陽性率為21.05%）。

從本研究結果來看，NIPT-plus 在檢測技術層面與羊膜腔穿刺染色體核型分析檢測結果存在差異，原因分析可能與下列因素相關：（1）NIPT-plus 檢測過程中存在極大的可能性被孕婦自身異常的 DNA 干擾，從而導致無創結果與核型分析結果不相符[14-16]。（2）可能導致 NIPT-plus 檢測結果出現性染色體非整倍體高風險異常的因素有以下幾種[17]，如性染色體互換、母體染色體嵌合、限制性胎盤嵌合、胎盤滋養層細胞等因素。因此，針對NIPT-plus 檢測結果提示性染色體異常的高風險病例，進一步進行羊膜腔穿刺術，并對羊水標本采用染色體核型分析、熒光原位雜交、分子核型分析等其他染色體及分子檢測技術，對于確診異常病例具有非常重要的意義[19-20]。雖然臨床醫師對于NIPTplus 的準確性和無創性普遍認可，但也存在假陽性病例的概率。因此，臨床上建議NIPT-plus 可作為高風險孕婦產前篩查的技術手段，必要時需聯合羊膜腔穿刺進行羊水細胞染色體核型分析進一步確診。

綜上所述，NIPT-plus 作為 NIPT 的升級版，是檢測胎兒13、18、21 染色體非整倍體異常以及亞顯微結構異常（微缺失/微重復）所致胎兒生長發育畸形、器官功能障礙及智力低下或殘疾等缺陷的有效手段[20-21]。該技術在高危孕婦產前篩查中對胎兒染色體異常風險的診斷與鑒別診斷具有重要意義，其研究結果可為產前診斷后期標準制定提供借鑒內容。