IL-6-572C/G、IL-6-174G/C基因多態性與梅毒感染的相關性分析

張英 李海燕 王西珍

梅毒是由梅毒螺旋體（treponema pallidum，TP）感染引起，是通過性傳播、母嬰傳播的一種慢性性病，梅毒感染可以增加人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的感染和傳播風險。根據全國性病病例報告，1989—2019 年以來，梅毒感染病例的報告率呈逐年增長趨勢，加重了全球公共衛生負擔[1-2]。梅毒發病機制尚未完全明確，有研究發現重組梅毒螺旋體蛋白Tp0768 通過激活NF-κB 通路和JNK 通路誘導白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 和白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）的表達，與健康對照組相比，梅毒患者IL-6、IL-2、IL-10 血清表達水平均明顯增高，在梅毒感染的起病、進展及預后中機體免疫應答、基因、遺傳易感性在發揮關鍵作用[3-4]。以往研究證實IL-6 基因啟動子區域的核苷酸基因多態性，可以導致基因轉錄和表達發生變化，影響個體對炎癥及多種免疫性疾病的易感性[5-6]，目前有關TP 感染與IL-6-572C/G、IL-6-174G/C 啟動子區單核苷酸多態性（single nucleotidepolymorphism，SNP）未見報道，本研究旨在探討IL-6（-572C/G、-174G/C）SNP 與梅毒感染的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入2020 年5 月—2021 年5 月至連云港市第二人民醫院就診的門診、住院梅毒確診患者80 例作為試驗組，男性35例，女性45例；年齡32～82歲，平均（48.59±11.74）歲。根據中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會行業標準（WS273—2018）中的《梅毒診斷》[7]進行梅毒感染疾病分期，其中輕度感染組為Ⅰ期、Ⅱ期共60 例，年齡32 ～77 歲，平均（47.58±12.78）歲；重度感染組為Ⅲ期共20 例，年齡32 ～84 歲，平均（49.02±11.36）歲。同時期至連云港市第二人民醫院體檢中心體檢的健康人作為對照組，共120 例，包括男性63 例，女性57 例，年齡27 ～88 歲，平均（50.98±17.46）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得江蘇省連云港市第二人民醫院倫理委員會批準（批件號：2019-029），研究對象均簽署了知情同意書。

納入標準：（1）經化學發光法檢測梅毒螺旋體抗體（treponema pallidum antibody，TP-Ab）陽性，甲苯胺紅不加熱血清（tolulized red unheated serum test，TRUST）試驗驗證陽性。（2）在連云港市第二人民醫院診治前3 個月內沒有任何免疫調節劑、激素類以及抗菌藥物的使用史。排除標準：（1）伴有其他性傳播疾病者。（2）妊娠期及哺乳期婦女。

1.2 主要儀器及試劑

雅培全自動免疫分析儀i2000 儀器（德國Abbott 公司）；數顯混勻器WZR-H6000（春妙上海醫療器械有限公司）；PCR 儀器（ABI Verti）；核酸電泳及凝膠成像系統（北京六一生物科技）；高速離心機（Thermo Fisher）；TRUST 診斷試劑盒（上海榮盛藥業有限公司）；天根DNA 提取試劑盒（天根生化北京有限公司）；M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix（北京聚合美生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物設計

在NCBI數據庫中下載從loci 22726410至loci 22727184的基因序列，包含IL-6基因 rs1800795（loci 22727026）、rs1800796 （Loc22726627）位點，用Snapgene 5.0.5軟件設計擴增目的基因的P C R 引物，引物序列如下：上游:5'- GCCAACCTCCTCTAAGTG-3'，下游: 5'-TCAGACATCTCCAGTCCTAT-3' ，委托杭州有康生物技術有限公司合成。

1.3.2 標本收集

研究對象清晨空腹6 ～8 h， 靜脈采血收集EDTA-K2抗凝全血和血清各5 mL。血常規檢測正常者，血清采用雅培全自動免疫分析儀i2000 儀器檢測TP-Ab 濃度，陰性的標本納入本次試驗的健康對照組。TP-Ab 檢測陽性者同時采用TRUST 試驗進行驗證，按照診斷試劑盒說明書操作，陽性者作為試驗組，將收集的標本置于-80 ℃儲存備用。

1.3.3 擴增目的基因

天根DNA 提取試劑盒提取500 μL 外周全血的DNA，嚴格按照操作說明書進行。DNA 產物濃度≥100 ng/μL 符合要求，在PCR 儀上反應擴增，擴增條件：95 ℃、5 min，1 個循環；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30 個循環；72 ℃、5 min，1 個循環，16 ℃ 持續。擴增產物取5 μL 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果，收集出現目的條帶的擴增產物，放至-80 ℃儲存備用。

1.3.4 研究產物測序

樣本的擴增產物委托杭州有康生物技術有限公司，樣本雙向測序，采用Sanger 雙脫氧終止測序法，在ABI3730xl全自動測序儀上進行。3730 Data Collection v3.0 軟件收集實驗數據，FinchTV（1.4.0 版）軟件分析IL-6-572C/G和IL-6-174G/C 位點基因多態性，分別采用rs1800796 和rs1800795 位點后10 個堿基，定位變異堿基的位置。

1.4 觀察指標

試驗組和對照組年齡、性別基礎資料分布，目的基因測序結果，rs1800796（IL-6-572C/G）、rs1800795（IL-6-174G/C）等位基因頻率、基因型以及不同遺傳模式下試驗組和對照組的基因型分布。

1.5 統計學方法

采用SPSS22.0 軟件對數據進行統計學分析。計量資料采用（±s）表示，兩樣本均數的比較采用t檢驗；計數資料采用n（%）表示，基因型和等位基因頻率采用直接計數法，兩組間比較采用χ2檢驗；Logistic 回歸模型分析IL-6 基因多態性和梅毒感染的相關性。P＜ 0.05 為差異有統計學意義

2 結果

2.1 對照組與試驗組患者一般資料比較

對照組與試驗組在性別、年齡等方面比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；輕度感染組與重度感染組在性別、年齡等方面比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1、表2。

表1 對照組與試驗組臨床一般資料比較

表2 重度感染組與輕度感染組臨床一般資料比較

2.2 目的基因擴增及測序

IL-6 基因目的片段擴增產物有771 bp，在 750 bp DNA標記物的附近。連云港地區漢族人群IL-6-572C/G 等位基因有C 和G，基因型可見CC、CG 和GG 3 種；IL-6-174G/C 等位基因包括C、G，基因型可見GG 和CG 2 種，見圖1。

圖1 IL-6 啟動子區-572 和-174 位點基因多態性測序結果

2.3 Logistic 回歸分析IL-6 基因多態性和梅毒感染的相關性。

IL-6-174G/C 和-572C/G 多態性在試驗和對照組中的分布頻率符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡（P＞0.05）。比較健康對照組和試驗組IL-6-572C/G 基因型和等位基因頻率，與CC 基因型相比，CG 和GG 兩組與梅毒感染組差異均無統計學意義（P＝O.428，OR＝1.75，95%CI0.44 ～6.97；P＝0.351，OR＝1.94，95%CI0.48 ～7.86），等位基因C和G 頻率在對照組和試驗組無明顯變化（P＝0.817，OR＝1.05，95%CI0.67 ～1.67），在顯性遺傳、隱性遺傳、共顯性遺傳等不同的遺傳模式下，基因型 CG+GG 和 CC，CC+CG 和GG，CC、CG 和 GG 都與梅毒感染不相關。IL-6-174C/G 基因型可見GG 與GC，等位基因G 和C，試驗組和對照組可見分布差異無統計學意義（P＝0.773，OR＝0.66，95%CI0.04 ～10.77，P＝0.874，OR＝0.66，95%CI0.04 ～10.71），見表3。

表3 IL-6-572C ＞G、-174C/G 等位基因頻率、基因型以及不同遺傳模式下的基因型分布 [ 例（%）]

3 討論

梅毒感染病變可累及皮膚、眼、骨頭、神經系統、心血管、腎臟、肝臟等多器官和臟器，引發嚴重的并發癥和死亡率。逃避免疫監視是梅毒感染的重要發病機制，梅毒螺旋體入侵機體早期，首先T 淋巴細胞介導的細胞免疫被激活，并在清除病原體中發揮重要作用。隨著病情進展到晚期，患者細胞免疫防御能力下降，Th1/Th2 細胞等免疫細胞及其分泌的細胞因子（TNF-α、IL-6 等）出現動態變化。梅毒螺旋體感染后增殖期，引發遲發性超敏反應，致敏CD4+T 細胞被激活，并在局部增殖并釋放、吸引和激活巨噬細胞的細胞因子，而遲發性超敏反應無效時則轉變為慢性病變。而免疫細胞分泌炎癥因子能夠調節機體的免疫應答，IL-6 為重要的免疫細胞因子。研究發現神經梅毒患者血清和腦脊液中 IL-6、IL-10 的含量明顯高于對照組，但是血清中的 IL-2、IL-12和 IFN-γ 含量低于對照組[8]。課題組前期研究發現江蘇省連云港地區梅毒患者IL-6 濃度比對照組顯著升高，而且Ⅲ期患者IL-6 血清濃度明顯高于Ⅱ期和I 期患者，說明IL-6 在梅毒感染的發生、發展過程中發揮了重要的作用。另有研究顯示 IL-6 基因啟動子區域中 SNP 對該基因的表達具有明顯的影響[9]。近年來IL-6 多態性研究廣泛，已經證實其SNP 和多種免疫性及感染性疾病相關性顯著。筆者推測梅毒患者IL-6 啟動子區域位點基因多態性，在梅毒感染過程中有一定的作用。

IL-6 主要由活化的單核細胞分泌，生理狀態下其水平較低，在病原體刺激下，表達量顯著升高。IL-6 表達受轉錄嚴格調控，IL-6 基因位于7p21 染色體上，全長5 kb，含有5 個外含子。IL-6 基因多態性主要表現在5'端啟動子區域-572、-174 等位點的G/C，G/A 單核苷酸變異。余波等[10]發現急性腦梗合并肺部感染患者IL-6 基因-572G 基因頻率較高，且基因型GG 頻率較高，G 基因可能是易感基因。另有研究發現，膿毒血癥患者IL-6 基因啟動子區-572C/G 基因型CC 及等位基因C 頻率明顯低于對照組，基因型GG 及等位基因G 頻率明顯高于對照組，膿毒血癥患者血清IL-6水平顯著高于健康組[11]。本研究發現IL-6 啟動子區-572 等位基因有C 和G，基因型有CC、CG 和GG3 種，IL-6 啟動子區-174 等位基因有C、G，基因型有GG 和CG 兩種，與上述研究發現一致。但是課題組進一步研究發現梅毒患者IL-6-174 基因型GG、CG 以及等位基因C 和G 頻率與健康人群中的分布并差異無統計學意義（P＞ 0.05），IL-6-572 3 種基因型和等位基因頻率和健康者同樣差異無統計學意義（P＞ 0.05），同時在顯性遺傳模式、隱性遺傳模式、共顯性遺傳模式下，試驗組和健康對照組之間均沒有關聯，這提示IL-6 啟動子區域-572 和-174 位點多態性與梅毒感染易感性無關。既往研究表明，梅毒感染與多個遺傳位點的SNP 聯合作用有關，即可能存在梅毒感染患病相關的基因間存在SNP 位點間的交互調控作用，且相關基因位點間的單體型也可能增大梅毒感染的患病風險[12-14]。這也進一步提示梅毒感染是由先天性免疫、遺傳易感性等共同作用的結果。

綜上所述，本研究首次證實IL-6-572C/G 和IL-6-174G/C 基因多態性與梅毒易感性沒有關聯，為后續IL-6基因多態性與梅毒感染的位點研究提供選擇依據。同時也存在一定的局限性：是小樣本單中心研究，僅分析了IL-6啟動子區2 個位點多態性，需要更大樣本多中心以及涉及IL-6 5'端和3'端多個位點的基因多態性的綜合研究，明確IL-6 基因SNP 與梅毒感染的相關性。文章中體現了中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會行業標準（WS273—2018）中的梅毒診斷執行標準[7]。