肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA、T-SPOT在菌陰肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

張帆 林健 林芬

肺結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性呼吸道傳染病，是全球公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的《結(jié)核病》報(bào)告，2019 年全球有1 000 萬(wàn)人患有肺結(jié)核，其中150 萬(wàn)人死亡。根據(jù)痰涂片和培養(yǎng)的結(jié)果，肺結(jié)核可分為菌陽(yáng)性和菌陰性兩種。菌陰肺結(jié)核是指3次痰涂片及1次培養(yǎng)陰性的肺結(jié)核，其發(fā)生率占肺結(jié)核的30%～40%。菌陰肺結(jié)核的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、影像學(xué)和組織病理學(xué)，但這些方法存在局限性和不確定性，導(dǎo)致診斷困難和誤診率高[2]。因此，探討菌陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)和方法，對(duì)于提高診斷準(zhǔn)確性、降低傳播風(fēng)險(xiǎn)、指導(dǎo)合理治療具有重要意義。肺泡灌洗液是一種從肺泡中獲取的液體樣本，可以反映肺部炎癥和感染的情況。肺泡灌洗液可以檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌的RNA、培養(yǎng)、涂片和結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T cell spot test，T-SPOT）等指標(biāo)，可能對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷有幫助。本文旨在探討肺泡灌洗液中結(jié)核桿菌RNA、X-pert、涂片檢查及T-SPOT 在菌陰肺結(jié)核診斷中的價(jià)值，為臨床提供參考依據(jù)。本研究的方法和結(jié)果均基于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的《肺結(jié)核診斷》。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究選取2022 年7 月1 日—2022 年9 月26 日在某醫(yī)院呼吸科就診的診斷為肺結(jié)核患者202 例。根據(jù)痰涂片和培養(yǎng)的結(jié)果，分析菌陰肺結(jié)核患者的基本資料，其中涉及患者的性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙史、飲酒史、接觸史等基線資料。其中診斷為菌陰肺結(jié)核病例134 例，其中男性75 例，女性59 例，年齡18 ～75 歲，平均（45.61±2.32）歲，BMI（21.46±3.40） kg/m2；41 例有吸煙史，93 例無(wú)吸煙史；36 例有飲酒史，98 例無(wú)飲酒史；22 例有接觸史，112 例無(wú)接觸史。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同意參與本研究并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有肺結(jié)核臨床癥狀，如咳嗽、咳痰、咯血、發(fā)熱、盜汗、消瘦等。（2）胸部X 線或CT 檢查有肺結(jié)核特征性改變，如空洞、纖維化、鈣化、粟粒結(jié)節(jié)等。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院后痰結(jié)核菌涂片陽(yáng)性患者。（2）有免疫缺陷或使用免疫抑制劑等影響免疫功能的情況。（3）有嚴(yán)重的心、肝、腎等器官功能不全或血液系統(tǒng)疾病。（4）拒絕接受肺泡灌洗液檢查或無(wú)法獲取足夠的肺泡灌洗液樣本。（5）有其他肺部感染或腫瘤等并發(fā)癥。

1.2 方法

1.2.1 肺泡灌洗液檢查

所有患者在空腹、清醒狀態(tài)下，經(jīng)纖維支氣管鏡插入病變部位，用生理鹽水（37 ℃）以20 ～40 mL/次，共100 ～200 mL 進(jìn)行肺泡灌洗，回收率≥50%。將肺泡灌洗液用于涂片、培養(yǎng)、X-pert（X-pert MTB/RIF system）、X-pertR（X-pert MTB/RIF ultra）耐藥[3]、結(jié)核脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、結(jié)核RNA、菌種鑒定、位點(diǎn)檢出和位點(diǎn)突變、以及T-SPOT 檢測(cè)，即11 種檢測(cè)方法。

1.2.2 涂片檢查

將肺泡灌洗液離心后，取沉淀物制作玻片，進(jìn)行抗酸染色和熒光染色，用顯微鏡觀察是否有結(jié)核分枝桿菌。每張玻片至少觀察100 個(gè)高倍視野，按照國(guó)際防治結(jié)核病和肺部疾病聯(lián)盟（The International Union Against Tuberculosis and Lung Disease，IUATLD）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)[4]。

1.2.3 培養(yǎng)檢查

將肺泡灌洗液離心后，使用MGIT960 儀器，取沉淀物接種于Lowenstein-Jensen 培養(yǎng)基和BACTEC MGIT 960 液體培養(yǎng)系統(tǒng)中，分別在37 ℃下培養(yǎng)4 ～8 周和6 ～8 周，觀察是否有結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)。對(duì)于生長(zhǎng)出的結(jié)核菌株，采用比例法進(jìn)行培養(yǎng)耐藥試驗(yàn)，測(cè)試異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素等藥物的敏感性。

1.2.4 X-pert 檢測(cè)

將肺泡灌洗液離心后，取沉淀物加入樣本試劑管中，振蕩混勻后放入賽沛儀器中，按照廠家說(shuō)明書進(jìn)行操作。該儀器可以同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的DNA 和利福平耐藥基因突變（rpoB 基因），結(jié)果在2 h 內(nèi)出現(xiàn)。

1.2.5 X-pertR 耐藥檢測(cè)

將肺泡灌洗液離心后，取沉淀物加入樣本試劑管中，振蕩混勻后放入Gene X-pert MTB/RIF Ultra 儀器中（美國(guó)Cepheid 公司生產(chǎn)），按照廠家說(shuō)明書進(jìn)行操作。該儀器可以同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的DNA 和利福平耐藥基因突變（rpoB 基因），并且比X-pert 更敏感和特異，結(jié)果在80 min內(nèi)出現(xiàn)。

1.2.6 結(jié)核DNA 檢測(cè)

將肺泡灌洗液離心后，使用ABI7500 儀器平臺(tái)取沉淀物提取DNA，采用實(shí)時(shí)熒光PCR 法擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌特異性基因片段整合子序列6110（insertion sequence 6110，IS6110） 和16S 核 糖 體RNA（16S ribosomal RNA，16S rRNA），并用SYBR Green I 染料進(jìn)行熒光定量。根據(jù)擴(kuò)增曲線和閾值循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）判斷是否陽(yáng)性。

1.2.7 結(jié)核RNA 檢測(cè)

將肺泡灌洗液離心后，取沉淀物提取RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光PCR 法擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌特異性基因片段16S核糖體RNA（16S ribosomal RNA，16S rRNA），并用SYBR Green I 染料進(jìn)行熒光定量。根據(jù)擴(kuò)增曲線和閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）判斷是否陽(yáng)性。

1.2.8 菌種鑒定

對(duì)于培養(yǎng)陽(yáng)性的結(jié)核菌株，在博奧晶典儀器平臺(tái)下，采用PCR- 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）法進(jìn)行菌種鑒定。提取菌種的DNA，擴(kuò)增hsp65基因，并用BstEII 酶切割產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段。將切割產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，并與已知的參考菌株進(jìn)行比較，確定菌種。

1.2.9 位點(diǎn)檢出

對(duì)于培養(yǎng)陽(yáng)性的結(jié)核菌株，同樣使用博奧晶典儀器平臺(tái)，采用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）法進(jìn)行位點(diǎn)檢出。提取菌株的DNA，擴(kuò)增katG、inhA、rpoB 等與耐藥相關(guān)的基因，并用變性凝膠電泳分離產(chǎn)生不同構(gòu)象的單鏈DNA。將電泳圖像與已知的正常或突變型進(jìn)行比較，確定是否有位點(diǎn)突變。

1.2.10 位點(diǎn)突變

對(duì)于位點(diǎn)檢出陽(yáng)性的結(jié)核菌株，采用PCR- 直接測(cè)序法進(jìn)行位點(diǎn)突變分析。提取菌株的DNA，擴(kuò)增與位點(diǎn)檢出相同的基因，并用自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與已知的正常或突變型進(jìn)行比較，確定突變類型和位置。

1.2.11 T-SPOT 檢測(cè)

將血液離心后，取細(xì)胞懸液加入T-SPOT 試劑盒中（由英國(guó)Oxford Immunotec Ltd 生產(chǎn)），按照廠家說(shuō)明書進(jìn)行操作。該試劑盒可以檢測(cè)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)結(jié)核特異性抗原早期分泌抗原目標(biāo)-6（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白-10（culture filtrate protein-10，CFP-10）刺激后釋放的干擾素-γ 水平。根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)判斷是否陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

本研究的主要評(píng)估指標(biāo)為各種檢測(cè)方法計(jì)算出菌陰肺結(jié)核患者的陽(yáng)性率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值；陽(yáng)性率是指檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果的比例，反映了檢測(cè)方法的敏感性，即能夠發(fā)現(xiàn)患者的能力。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是指陽(yáng)性結(jié)果者中患者的比例，反映了檢測(cè)方法在特定人群中陽(yáng)性結(jié)果的可信度，與患病率有關(guān)。陰性預(yù)測(cè)值是指陰性結(jié)果者中非患者的比例，反映了檢測(cè)方法在特定人群中陰性結(jié)果的可信度，也與患病率有關(guān)[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。單變量統(tǒng)計(jì)分析各種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。

2 結(jié)果

不同的結(jié)核病檢測(cè)方法在不同指標(biāo)上的表現(xiàn)存在很大的差異。比如，T-SPOT 方法的陽(yáng)性率最高（82.8%），表明該方法最敏感，能夠檢測(cè)出大部分患者。同樣，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值也最高（82.8%），說(shuō)明在陽(yáng)性結(jié)果者中患者的比例最高，也就是說(shuō)假陽(yáng)性率最低。這意味著T-SPOT 方法雖然能夠發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者，但也會(huì)漏診一些患者。其次，涂片方法的陽(yáng)性率最低（11.9%），說(shuō)明它最不敏感，只能檢測(cè)出少數(shù)患者。其他方法的陽(yáng)性率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值都較低，說(shuō)明它們?cè)谠\斷方面的效果都不理想。因此，選擇合適的結(jié)核病檢測(cè)方法需要綜合考慮多個(gè)指標(biāo)，并根據(jù)具體情況進(jìn)行權(quán)衡，見(jiàn)表1。

表1 不同檢測(cè)方法的比較（%）

3 討論

肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA、培養(yǎng)、涂片檢查及結(jié)核感染T-SPOT 是目前用于診斷菌陰肺結(jié)核的常用方法[6-7]。菌陰肺結(jié)核是指在臨床上有結(jié)核病癥狀和體征，但在痰涂片或培養(yǎng)中未能檢出結(jié)核分枝桿菌的患者[8]。菌陰肺結(jié)核的診斷難度較大，容易漏診或誤診，影響患者的治療效果和預(yù)后，也增加了結(jié)核病的傳播風(fēng)險(xiǎn)[9]。因此，探討肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA、X-pert、涂片檢查及T-SPOT 在菌陰肺結(jié)核診斷中的價(jià)值具有重要的臨床意義和研究?jī)r(jià)值。

結(jié)果顯示，T-SPOT 方法是最能檢測(cè)菌陰肺結(jié)核患者的方法，其陽(yáng)性率和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值都是最高的，但也有最高的假陰性率，可能會(huì)漏掉一些患者。涂片方法的陽(yáng)性率和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值都是最低的，但也有最低的假陽(yáng)性率，可能會(huì)多診斷一些患者。X-pert 方法和菌種鑒定方法的陽(yáng)性率都比較中等，但其在識(shí)別患者方面稍微好一點(diǎn)，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值都比菌種鑒定方法高一點(diǎn)。其他方法在診斷方面都不太好，陽(yáng)性率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值的值也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。這一結(jié)果與世衛(wèi)組織的《結(jié)核病》報(bào)告中推薦的檢測(cè)方法相一致，也與國(guó)內(nèi)外其他相關(guān)研究基本一致[10-12]，也顯示了本文方法在菌陰肺結(jié)核診斷中的創(chuàng)新性。如果要選擇一個(gè)檢測(cè)方法來(lái)指導(dǎo)臨床工作，建議選擇T-SPOT 方法或X-pert方法[13-14]，因?yàn)樗鼈兙哂休^高的陽(yáng)性率和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別出大部分患者，并且避免不必要的干預(yù)。還需要考慮其他因素，如檢測(cè)成本、可用性、時(shí)間等，進(jìn)行綜合評(píng)定[15]。

未來(lái)階段的工作重點(diǎn)主要有以下幾點(diǎn)：（1）進(jìn)一步優(yōu)化肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA 檢測(cè)法的操作流程和技術(shù)參數(shù)，提高其穩(wěn)定性和可重復(fù)性。（2）進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加對(duì)照組和隨訪時(shí)間，評(píng)估肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA 檢測(cè)法在不同類型和程度的菌陰肺結(jié)核患者中的應(yīng)用價(jià)值和準(zhǔn)確度。同時(shí)，也需要探討肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA 檢測(cè)法與其他方法（如X-pert MTB/RIF、LAMP 等）的聯(lián)合應(yīng)用效果，以提高菌陰肺結(jié)核診斷的敏感性和特異性。開展多中心、大樣本、前瞻性的臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA 檢測(cè)法在不同人群和地區(qū)的適用性和準(zhǔn)確性。（3）探索肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA 檢測(cè)法在監(jiān)測(cè)治療效果、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、指導(dǎo)用藥方案等方面的作用和意義。以及探討肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA 檢測(cè)法在耐藥結(jié)核分枝桿菌和位點(diǎn)突變分析方面的作用和意義。

綜上所述，本文探討了肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA、X-pert、涂片檢查及T-SPOT 在菌陰肺結(jié)核診斷中的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)T-SPOT 方法和X-pert 方法具有較高的陽(yáng)性率和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別出大部分患者，是較為可靠的診斷方法。本文的結(jié)果與最新的研究文獻(xiàn)基本一致，也顯示了本文方法在菌陰肺結(jié)核診斷中的創(chuàng)新性。但是，本文也存在一些局限性，如樣本量較小、沒(méi)有進(jìn)行受試者工作特征曲線分析和成本效益評(píng)估等，需要在未來(lái)的工作中進(jìn)行改進(jìn)和完善。同時(shí)，也需要進(jìn)一步探索肺泡灌洗液結(jié)核桿菌RNA 檢測(cè)法在監(jiān)測(cè)治療效果、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、指導(dǎo)用藥方案等方面的應(yīng)用價(jià)值和意義，以及在耐藥結(jié)核分枝桿菌和位點(diǎn)突變分析方面的作用和意義。本文為菌陰肺結(jié)核的診斷提供了一種新的思路和方法，為臨床工作和科學(xué)研究提供了一定的參考和借鑒。