珠海地區(qū)新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查正常參考區(qū)間建立的臨床研究

汪國慶 林萃 呂曉萍 譚功軍 周玉球

遺傳代謝病是由于基因突變引起參與體內(nèi)代謝的酶、運載蛋白、膜或受體缺陷, 導致機體代謝紊亂, 造成中間、旁路代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺乏, 引發(fā)一系列臨床癥狀的一組疾病［1］。目前, 串聯(lián)質(zhì)譜已經(jīng)發(fā)展成為早期發(fā)現(xiàn)和篩查遺傳代謝病的最重要的平臺之一, 越來越多的國家和地區(qū)采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行新生兒遺傳代謝病篩查。本研究旨在通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對珠海地區(qū)20364 例新生兒干血斑樣本中11 種氨基酸和31 種肉堿含量進行檢測, 并按納入標準篩選其中18542 例新生兒篩查結(jié)果進行統(tǒng)計分析, 建立珠海地區(qū)正常新生兒群體串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查42 項指標的參考區(qū)間, 以期為本地區(qū)新生兒遺傳代謝病篩查提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 資料來源于2021 年1 月～2022 年12 月在珠海地區(qū)各分娩機構(gòu)出生的20364 例新生兒串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查結(jié)果。納入標準：足月、正常出生體重、出生后3～7 d 采血的健康新生兒。共篩選出18542 例新生兒, 其中男9814 例, 女8728 例。本研究通過珠海市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會審批(2020112501), 所有篩查對象監(jiān)護人均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集出生72 h 后并充分哺乳的新生兒足跟血, 滴于S&S903 專用濾紙上制成血片, 按要求填寫各項資料, 將血片懸空平置自然晾干, 裝入防潮避光袋密封保存于冰箱(2～8℃), 5 個工作日內(nèi)遞送至珠海市婦幼保健院進行檢測。

1.2.2 儀器和試劑 美國AB SCIEX API3200MD 串聯(lián)質(zhì)譜儀、PerkinElmer Puncher 9 全自動打孔儀、杭州奧盛MB100-2A 恒溫孵育振蕩器, 試劑采用PerkinElmer公司生產(chǎn)的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒, S&S903 新生兒篩查專用濾紙由杭州杰毅麥特公司生產(chǎn)(浙杭械備20210259)。

1.2.3 檢測方法 嚴格按照PerkinElmer 非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒說明書操作。用Puncher 9 打孔器取直徑 3 mm 的待測樣品和質(zhì)控品血斑置于 96 孔萃取板中；每孔加入100 μl 含有氨基酸、肉堿內(nèi)標的工作液(以氨基酸、肉堿內(nèi)標原液和萃取液按1∶108 比例配制)；用粘性膜覆蓋96 孔萃取板后上恒溫孵育振蕩器, 以45℃、650 r/min 的條件萃取45 min；取出萃取板恢復至室溫后, 轉(zhuǎn)移75 μl 萃取液至96 孔V 型板中, 用鋁箔紙覆蓋后上串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

1.2.4 質(zhì)量控制 每塊96 孔檢測板均加入試劑盒自帶的兩個不同水平質(zhì)控品進行質(zhì)量控制, 保證實驗結(jié)果的準確性；參加國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心組織的室間質(zhì)量評價, 成績均為合格。

1.3 觀察指標

1.3.1 11 種氨基酸 包括丙氨酸(alanine, Ala)、精氨酸(arginine, Arg)、瓜氨酸(citrulline, Cit)、甘氨酸(glycine,Gly)、亮氨酸(leucine, Leu)、甲硫氨酸(methionine, Met)、鳥氨酸(ornithine, Orn)、苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)、脯 氨 酸(proline, Pro)、酪 氨 酸(tyrosine, Tyr)、纈 氨 酸(valine, Val)。

1.3.2 31 種肉堿 包括游離肉堿(free carnitine, C0)、乙酰肉堿(acetylcarnitine, C2)、丙酰肉堿(propionylcarnitine,C3)、丙二酰肉堿+3- 羥基丁酰肉堿(malonylcarn itine+3-hydroxy butyrylcarnitine, C3DC+C4OH)、丁酰肉堿(butyrylcarnitine, C4)、甲基丙二酰肉堿+3-羥基異戊酰肉堿(methylmalonylcarnitine+3-hydroxyisovalerylcarnitine,C4DC+C5OH)、異戊酰肉堿(isovalerylcarnitine, C5)、異戊烯酰肉堿(isopentenylcarnitine, C5:1)、戊二酰肉堿+3-羥基己酰肉堿(glutarylcarnitine+3-hydroxyhexanoyl carnitine, C5DC+C6OH)、己 酰 肉 堿(hexanoylcarnitine,C6)、己二酰肉堿( adipylcarnitine, C6DC)、辛酰肉堿(capryloylcarnitine, C8)、辛 烯 酰 肉 堿(octanoylcarnitine,C8:1)、癸酰肉堿(decanoylcarnitine, C10)、癸烯酰肉堿(decenoylcarnitine, C10:1)、癸二烯酰肉堿(decadienoylcarnitine, C10:2)、月桂酰肉堿(dodecanoylcarnitine,C12)、月 桂 烯 酰 肉 堿(dodecenoylcarnitine, C12:1)、肉豆蔻酰肉堿(tetradecanoylcarnitine, C14)、肉豆蔻烯酰肉堿(tetradecenoylcarnitine, C14:1)、肉豆蔻二烯酰肉堿(tetradecad ienoylcarnitine, C14:2)、3-羥基肉豆蔻烯酰 肉 堿(3-hydroxyl-tetradecanoylcarnitine, C14OH)、棕櫚 酰 肉 堿(hexadecan oylcarnitine, C16)、棕 櫚 烯 酰 肉堿(hexadecenoylcarnitine, C16:1)、3-羥基棕櫚酰肉堿(3-hydroxypalmitoylcarnitine, C16OH)、3- 羥 基 棕 櫚 烯酰 肉 堿(3-hydroxypalmitoleylcarnitine, C16:1OH)、十 八碳酰肉堿(octadecanoylcarnitine, C18)、十八碳烯酰肉堿(octadecenoylcarnitine, C18:1)、十八碳二烯酰肉堿(octadecadienoylcarnitine, C18:2)、3-羥基十八碳酰肉堿(3-hydroxystearoylcarnitine, C18OH)、3-羥基十八碳烯酰肉堿(3-hydroxyoleylcarnitine, C18:1OH)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差 (±s)表示；采用Kolmogorov-Smirnovs(K-S)檢驗正態(tài)分布, 百分位數(shù)法(P0.5～P99.5)建立參考區(qū)間, 摘要獨立樣本t 檢驗比較珠海地區(qū)串聯(lián)質(zhì)譜檢測結(jié)果與中國臨床機構(gòu)的差異,Wilcoxon 秩和檢驗比較珠海地區(qū)參考區(qū)間與上海新華醫(yī)院的差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 新生兒遺傳代謝病篩查結(jié)果 20364 例新生兒初篩陽性687 例, 召回621 例, 確診遺傳代謝病7 例, 其中原發(fā)性肉堿缺乏癥2 例, citrin 蛋白缺乏癥、高甲硫氨酸血癥、甲基丙二酸血癥、中鏈?；o酶A 脫氫酶缺乏癥和極長鏈?；o酶A 脫氫酶缺乏癥各1 例。氨基酸代謝病、有機酸代謝病、脂肪酸氧化障礙的發(fā) 病 率 分 別 為0.010%(1/10182)、0.005%(1/20364) 和0.020%(1/5091), 總發(fā)病率為0.034%(1/2909)。見表1。

表1 20364 例新生兒遺傳代謝病篩查結(jié)果(n, %)

2.2 11 種氨基酸和31 種肉堿參考區(qū)間的建立18542 例正常新生兒干血斑樣本中11 種氨基酸和31 種肉堿含量的檢測結(jié)果經(jīng)K-S 檢驗正態(tài)性, 結(jié)果均呈偏態(tài)分布, 故以百分位數(shù)法(P0.5～P99.5)統(tǒng)計出11 種氨基酸和31 種肉堿的參考區(qū)間。見表2。

2.3 11 種氨基酸和31 種肉堿檢測結(jié)果與中國臨床機構(gòu)測定結(jié)果比較 18542 例新生兒11 種氨基酸檢測結(jié)果與中國臨床機構(gòu)檢測結(jié)果比較, 差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)； 18542 例新生兒31 種肉堿中除C5:1、C6、C8、C10:2、C14:2、C16OH、C16:1OH、C18OH、C18:1OH 等指標外, 其余肉堿檢測結(jié)果與中國臨床機構(gòu)檢測結(jié)果比較, 差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。見表3。

表3 18542 例正常新生兒干血斑樣本中11 種氨基酸和31 種肉堿測定結(jié)果與中國臨床機構(gòu)測定結(jié)果比較( ±s, μmol/L)

指標 本實驗室 中國臨床機構(gòu)# t P Ala 263.75±61.39a 374.53±114.18 -54.519 ＜0.001 Arg 5.61±4.51a 18.40±9.34 -77.317 ＜0.001 Cit 12.67±3.47a 16.67±5.62 -39.684 ＜0.001 Gly 452.91±112.89a 617.47±221.99 -41.763 ＜0.001 Leu 181.89±35.34a 167.96±42.98 17.640 ＜0.001 Met 21.04±4.63a 26.68±7.08 -44.244 ＜0.001 Orn 87.49±23.19a 153.36±68.70 -54.699 ＜0.001 Phe 48.36±9.49a 56.07±12.02 -35.059 ＜0.001 Pro 168.21±38.07a 234.25±63.72 -57.904 ＜0.001 Tyr 103.71±39.72a 118.60±44.97 -17.873 ＜0.001 Val 123.16±26.61a 165.41±42.51 -55.366 ＜0.001 C0 19.39±6.65a 21.92±7.05 -19.207 ＜0.001 C2 22.32±7.26a 19.74±7.15 18.903* ＜0.001

續(xù)表3

表3 18542 例正常新生兒干血斑樣本中11 種氨基酸和31 種肉堿測定結(jié)果與中國臨床機構(gòu)測定結(jié)果比較( ±s, μmol/L)

注：與中國臨床機構(gòu)比較, aP＜0.001；#：來源于試劑說明書；*：方差齊性檢驗中P＞0.05, 顯示方差齊, 選擇未校正t 值,其余結(jié)果方差不齊, 選擇校正t 值

指標 本實驗室 中國臨床機構(gòu)# t P C3 1.76±0.67a 1.91±0.78 -10.415 ＜0.001 C3DC+C4OH 0.14±0.07a 0.10±0.05 39.663 ＜0.001 C4 0.20±0.07a 0.22±0.07 -15.163* ＜0.001 C4DC+C5OH 0.18±0.05a 0.20±0.06 -18.116 ＜0.001 C5 0.10±0.03a 0.13±0.06 -28.190 ＜0.001 C5:1 0.01±0.002 0.01±0.004 0 1 C5DC+C6OH 0.11±0.04a 0.12±0.05 -10.917 ＜0.001 C6 0.04±0.02 0.04±0.02 0* 1 C6DC 0.12±0.05a 0.09±0.04 38.205 ＜0.001 C8 0.06±0.02 0.06±0.02 0* 1 C8:1 0.08±0.03a 0.14±0.06 -56.38 ＜0.001 C10 0.09±0.04a 0.07±0.03 33.459 ＜0.001 C10:1 0.06±0.02a 0.05±0.02 26.536* ＜0.001 C10:2 0.01±0.003 0.01±0.01 0 1 C12 0.10±0.06a 0.08±0.04 24.326 ＜0.001 C12:1 0.06±0.05a 0.04±0.03 31.395 ＜0.001 C14 0.19±0.07a 0.18±0.06 8.612 ＜0.001 C14:1 0.10±0.06a 0.07±0.04 36.49 ＜0.001 C14:2 0.02±0.01 0.02±0.01 0* 1 C14OH 0.02±0.01a 0.01±0.01 53.071* ＜0.001 C16 3.51±1.24a 2.80±1.08 34.075 ＜0.001 C16:1 0.20±0.09a 0.16±0.08 26.016 ＜0.001 C16OH 0.02±0.01 0.02±0.01 0* 1 C16:1OH 0.04±0.01 0.04±0.02 0 1 C18 0.92±0.31a 0.77±0.26 29.682 ＜0.001 C18:1 1.40±0.39a 1.35±0.42 6.385 ＜0.001 C18:2 0.20±0.10a 0.27±0.13 -29.506 ＜0.001 C18OH 0.01±0.01 0.01±0.01 0* 1 C18:1OH 0.02±0.01 0.02±0.01 0* 1

2.4 珠海地區(qū)新生兒與上海新華醫(yī)院新生兒串聯(lián)質(zhì)譜參考區(qū)間比較 珠海地區(qū)新生兒各指標參考區(qū)間上、下限與上海新華醫(yī)院新生兒各指標參考區(qū)間［2］上、下限差值進行正態(tài)性檢驗, 結(jié)果均呈偏態(tài)分布, 因此采用Wilcoxon 秩和檢驗與上海新華醫(yī)院參考區(qū)間進行比較。珠海地區(qū)新生兒Ala、Gly、Leu、Orn、Phe、Tyr、Val、C0、C6DC 參考區(qū)間下限與新華醫(yī)院新生兒比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 珠海地區(qū)新生兒與上海新華醫(yī)院新生兒串聯(lián)質(zhì)譜參考區(qū)間比較(μmol/L)

3 討論

自1990 年串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)首次應(yīng)用于新生兒遺傳代謝病篩查以來, 因其快速、高靈敏度、高通量等特點, 在新生兒遺傳代謝病篩查領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用, 并取得了較好的效果［3］。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以在一次分析中篩查超過50 余種遺傳代謝病, 包括氨基酸代謝病、有機酸代謝病和脂肪酸氧化障礙等疾?。?］。雖然串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查單一病種檢出率較低, 但其總體檢出率相對較高, 且不同國家和地區(qū)存在差異［5,6］。本研究結(jié)果顯示, 珠海地區(qū)氨基酸代謝病的發(fā)病率為0.010%(1/10182), 有機酸代謝病的發(fā)病率為0.005%(1/20364), 脂肪酸氧化障礙的發(fā)病率為0.020%(1/5091)；總發(fā)病率為0.034%(1/2909), 與蘇州市的發(fā)病率0.034%(1/2910)［7］相近, 略低于廣州市發(fā)病率的0.041%(1/2451)［6］, 但稍高于全國平均水平的0.032%(1/3153)［8］。在疾病構(gòu)成比方面, 本組資料確診的脂肪酸氧化障礙占比最高, 達57.1% (4/7), 其次為氨基酸代謝異常, 占28.6%(2/7), 有機酸代謝異常最少,占14.3%(1/7)。構(gòu)成比與廣州［6］和揚州［9］相近, 但與上海［10］和吉林［11］等地有所不同。

串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查是指通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對新生兒群體中的氨基酸和肉堿等代謝物指標進行檢測, 在新生兒尚未出現(xiàn)臨床癥狀時做出早期診斷和早期治療, 避免患兒重要器官出現(xiàn)不可逆損害, 以保障兒童正常的身體和智力發(fā)育。而準確評估新生兒群體中氨基酸和肉堿等代謝物指標是否異常有賴于可靠的參考區(qū)間, 目前對于遺傳代謝病篩查指標的切值建立尚無統(tǒng)一標準, 同一指標在不同實驗室或不同方法之間存在較大的差異［12］。何法霖等［13］對我國28 個省市141 家開展串聯(lián)質(zhì)譜新生兒遺傳代謝病篩查實驗室的調(diào)查結(jié)果顯示, 大部分實驗室的切值選擇了試劑廠家說明書, 只有14%的實驗室自己確定, 使用非衍生法進行篩查的實驗室的切值主要來源于試劑廠家說明書。不合理的切值設(shè)置易導致過多的假陽性和假陰性,降低陽性預測值, 因此制定適合本地區(qū)的切值尤為重要。本研究按納入標準篩選出18542 例新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果, 參照“新生兒遺傳代謝病篩查指標切值建立方法專家共識”［12］, 采用百分位數(shù)法(P0.5～P99.5)建立了珠海地區(qū)正常新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查11 種氨基酸和31 種肉堿的參考區(qū)間。同時為探討試劑廠家參考區(qū)間在珠海地區(qū)的適用性, 本研究將18542 例新生兒的檢測結(jié)果與試劑說明書中的中國臨床機構(gòu)測定結(jié)果進行了比較, 結(jié)果顯示, 18542 例新生兒11 種氨基酸檢測結(jié)果與中國臨床機構(gòu)檢測結(jié)果比較, 差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)； 18542 例新生兒31 種肉堿中除C5:1、C6、C8、C10:2、C14:2、C16OH、C16:1OH、C18OH、C18:1OH 等指標外, 其余肉堿的檢測結(jié)果與中國臨床機構(gòu)檢測結(jié)果比較, 差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。上述結(jié)果與李銘等［14］的報道略有不同。此外本研究將所建立的參考區(qū)間與全國普遍使用的上海新華醫(yī)院新生兒的參考區(qū)間進行了比較, 結(jié)果表明, 珠海地區(qū) 新 生 兒Ala、Gly、Leu、Orn、Phe、Tyr、Val、C0、C6DC 參考區(qū)間下限與新華醫(yī)院新生兒比較, 差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。本地區(qū)與中國臨床機構(gòu)檢測結(jié)果及上海新華醫(yī)院參考區(qū)間存在差異的主要原因可能與地區(qū)差別、飲食習慣差異及珠海外來人口較多、人員結(jié)構(gòu)相對復雜等因素有關(guān), 因此各實驗室應(yīng)根據(jù)當?shù)厝巳簷z測結(jié)果建立自己的參考區(qū)間。

本次研究中共篩查20364 例新生兒, 初篩陽性687 例, 召回621 例, 確診遺傳代謝病7 例, 陽性預測值為1.13%(7/621), 明顯低于國內(nèi)的報道(廣州4.5%、常州3.38%)［7,15］, 原因可能與實驗室所采用的參考區(qū)間不合理有關(guān)。本研究依據(jù)18542 例新生兒的檢測結(jié)果建立了參考區(qū)間, 并對資料中初篩陽性數(shù)及確診數(shù)均為最多的“原發(fā)性肉堿缺乏癥”篩查指標C0 的參考區(qū)間進行了初步驗證。依據(jù)實驗室所使用的C0 參考區(qū)間(9～55 μmol/L), “原發(fā)性肉堿缺乏癥”的初篩陽性數(shù)為245 例, 召回227 例, 確診2 例, 陽性預測值為0.88%；若采用本研究所建立的參考區(qū)間, “原發(fā)性肉堿缺乏癥”的初篩陽性數(shù)下降至104 例, 召回98 例,確診2 例, 陽性預測值上升至2.04%, 可見本地區(qū)參考區(qū)間的建立對降低篩查假陽性率、提高陽性預測值具有重要的現(xiàn)實意義。許多研究結(jié)果表明, 胎齡、出生體重對新生兒串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查結(jié)果均存在影響［16-18］。鑒于本研究中早產(chǎn)兒及低出生體重兒的數(shù)量有限, 課題組基于18542 例新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查數(shù)據(jù),先行建立了該地區(qū)正常新生兒串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查42 個指標的參考區(qū)間, 今后隨著篩查量的增加, 在優(yōu)化和調(diào)整本地區(qū)正常新生兒遺傳代謝病篩查指標參考區(qū)間的同時, 逐步建立本地區(qū)早產(chǎn)兒及低出生體重兒的參考區(qū)間, 以降低篩查的假陽性率和假陰性率、提高陽性預測值及篩查效率, 為本地區(qū)新生兒遺傳代謝病篩查的實驗診斷提供可靠的依據(jù)。

綜上所述, 珠海地區(qū)新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查11 種氨基酸和31 種肉堿參考區(qū)間的建立, 為本地區(qū)新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查的結(jié)果解讀提供了理論依據(jù)。