豬流行性腹瀉病毒Nsp6蛋白的分段表達及多克隆抗體制備

陳東奇，鄭殿重，2，魏志穎，王瑩，李佳璇，崔文，姜艷平，王曉娜，周晗，王麗，喬薪瑗，李一經，唐麗杰，單智夫*

(1.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農業科學院畜牧所，黑龍江 哈爾濱 150030)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)感染引起豬的一種急性烈性腸道傳染病。該病呈世界性分布，以腹瀉、脫水、嘔吐為主要臨床特征，常可導致仔豬死亡。PEDV感染嚴重影響動物的生產性能，自2010年以來，在包括中國在內的主要養豬國家暴發和流行，成為最重要的豬病毒性腹瀉病之一，極大地阻礙了全球養豬業的健康發展[1]。對于PED的防控，最主要的措施是接種疫苗。然而，由于PEDV亞型多、具有很強的變異性，且存在持續性感染，接種疫苗并沒有達到預期的預防效果。PEDV的致病機制復雜，臨床上目前沒有有效的治療藥物。因此，深入研究PEDV的致病機制對該病的防控具有重要意義。

細胞自噬是一種具有多種調節功能、可維持真核細胞穩態的正常細胞生理活動。目前研究發現，細胞自噬與病毒的感染與復制之間存在著密切的聯系，如自噬可降解侵染細胞的病毒，同時病毒可阻礙自噬的發生，以逃避自噬對其本身復制的影響，甚至某些病毒會利用自噬體促進自我復制。目前對PEDV感染的致病機制，尤其是誘導細胞自噬的機制仍不十分清楚。Guo等[2]發現自噬有利于PEDV復制，并且自噬可能與炎性細胞因子的表達有關，在PEDV感染期間與NF-κB信號通路具有正反饋調節作用。用雷帕霉素誘導細胞自噬會抑制PEDV的感染，并減輕PEDV誘導上皮細胞的死亡[3]。Sun等[4]發現活性氧(reactive oxygen species，ROS)在PEDV感染期間在調節內質網(endoplasmic reticulum，ER)應激介導的自噬中發揮重要作用，并且PERK和IER1通路參與誘導ROS依賴性內質網應激介導的自噬。Lin等[5]篩選出PEDV非結構蛋白6(Nsp6)可誘導IPEC-J2細胞發生細胞自噬，是能夠引起細胞自噬的關鍵蛋白，然而其誘導細胞自噬的關鍵功能域尚未確定。因此，本研究獲得了在大腸桿菌系統中重組表達的PEDV Nsp6重組蛋白，純化后免疫小鼠制備相應的多克隆抗體，用于鑒定Nsp6 分段基因的真核表達情況，為進一步確定Nsp6蛋白誘導細胞自噬的關鍵功能域奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4周齡雌性BALB/c小鼠購自遼寧長生實驗動物中心。PEDV毒株CH/HLJ/18(GenBank:MW561264.1)、豬小腸上皮細胞IPEC-J2購自上海信裕生物科技有限公司；鼠抗PEDV-N蛋白單克隆抗體、pMD19-T Simple載體、pSUMO原核表達載體pCMV-HA真核表達載體、大腸桿菌DH5α感受態細胞及大腸桿菌Rosetta感受態細胞均由本實驗室保存；小鼠抗His標簽、HA標簽單克隆抗體均購自賽默飛世爾科技公司；HRP/FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋公司；T4 DNA連接酶、dNTP Mixture、DNA Marker 及PageRulerTMPlus預染蛋白分子量標準購自寶生物工程(大連)公司；中劑量質粒提取試劑盒購自Promega公司；限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ均購自NEB公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 PCR引物的設計與合成

參照GenBank中PEDV Nsp6基因序列(Gene ID：935181)及SMART網站對Nsp6基因功能域的預測，將Nsp6基因分為Nsp6-1、Nsp6-2、Nsp6-3段，并使用Oligo 6.0軟件設計克隆引物對Nsp6-F/Nsp6-R、N1-F/N1-R、N2-F/N2-R和N3-F/N3-R(見表1)，分別用于PEDV Nsp6、Nsp6-1、Nsp6-2、Nsp6-3基因的擴增。

表1 引物序列

1.3 目的基因的擴增及重組質粒的構建與鑒定

提取感染PEDV 的 IPEC-J2 細胞總RNA，經反轉錄成cDNA后，以Nsp6-F/Nsp6-R為引物對，擴增PEDV Nsp6基因。PCR擴增結束后，對PCR產物進行純化并對回收片段雙酶切(BamHⅠ和XhoⅠ)，再利用T4 DNA連接酶在16 ℃下作用14 h，連接到同樣雙酶切處理的pSUMO原核表達載體上。將連接產物熱轉化至大腸桿菌Rosetta感受態細胞，涂布在含卡那霉素抗性的LB固體培養基上，倒置于37 ℃培養箱中培養；12 h后隨機挑取單菌落并進行擴大培養，提取質粒。一方面以質粒為模板進行PCR鑒定；另一方面進行雙酶切鑒定，鑒定正確的質粒送吉林庫美有限公司進行測序驗證，測序正確的質粒命名為pSUMO-Nsp6，菌種命名為pSUMO-Nsp6/Rosetta。

以pSUMO-Nsp6質粒為模板，分別以Nsp6-F/Nsp6-R、N1-F/N1-R、N2-F/N2-R及N3-F/N3-R為引物對，PCR擴增PEDV Nsp6、Nsp6-1、Nsp6-2、Nsp6-3基因。將膠回收產物與pMD19-T Simple連接，再將連接產物熱轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布在含氨芐青霉素抗性的LB固體培養基上培養后隨機挑取單菌落并進行擴大培養，提取質粒。一方面以質粒為模板進行PCR鑒定；另一方面進行單、雙酶切鑒定，均正確的質粒送吉林庫美有限公司進行測序驗證，測序正確的質粒分別命名為pMD-19T-Nsp6、pMD-19T-Nsp6-1、pMD-19T-Nsp6-2、pMD-19T-Nsp6-3，菌種分別命名為pMD-19T-Nsp6/DH5α、pMD-19T-Nsp6-1/DH5α、pMD-19T-Nsp6-2/DH5α、pMD-19T-Nsp6-3/DH5α。

分別提取pMD-19T-Nsp6、pMD-19T-Nsp6-1、pMD-19T-Nsp6-2、pMD-19T-Nsp6-3及pCMV-HA質粒，利用限制性核酸內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，利用膠回收試劑盒回收目的片段。將膠回收的目的片段與pCMV-HA真核表達載體連接，并將連接產物熱轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞培養；12 h后隨機挑取單菌落并進行擴大培養，提取質粒。一方面以質粒為模板進行PCR鑒定；另一方面進行單、雙酶切鑒定，均正確的質粒送吉林庫美有限公司進行測序驗證，測序正確的質粒分別命名為pCMV-Nsp6、pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2、pCMV-Nsp6-3，菌種分別命名為pCMV-Nsp6/DH5α、pCMV-Nsp6-1/DH5α、pCMV-Nsp6-2/DH5α、pCMV-Nsp6-3/DH5α。

1.4 PEDV Nsp6的原核表達及鑒定

將重組大腸桿菌pSUMO-Nsp6/Rosetta培養至OD600 nm為0.5時，取1 mL誘導前的菌體和上清液樣品作為對照，其余加入IPTG進行誘導，使IPTG終濃度為1.0 mmol/L，于37 ℃震蕩培養12 h后，離心收集菌體沉淀重懸并超聲破碎，再次離心后分別收集超聲后的沉淀和上清液，分別加入125 μL 5×SDS，混勻后置于沸水中作用10 min，用于SDS-PAGE和Western blot鑒定。分別配制12%分離膠和5%積層膠，用于SDS-PAGE檢測。點樣后進行電泳，80 V電泳1 h，120 V電泳2 h；電泳結束，將凝膠放入考馬斯亮藍染色液中，置于室溫染色30 min，經脫色液脫色后，觀察蛋白表達情況。用同樣方法將電泳后的蛋白轉印至0.2 μm PVDF膜，在100 V電壓下濕轉1.5 h；放入5%脫脂乳在室溫條件下封閉2 h后，利用 1×PBST反復清洗PEDV膜并加入小鼠抗His標簽的單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標記的標記山羊抗鼠IgG為二抗，依次經室溫孵育1 h后進行ECL顯色。

1.5 真核表達質粒的轉染與蛋白表達和鑒定

使用Promega中劑量質粒提取試劑盒制備無內毒素質粒pCMV-Nsp6、pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2和pCMV-Nsp6-3備用，將IPEC-J2細胞鋪至24孔板中，調整細胞密度為5×105個/孔，待細胞長成單層后進行轉染。向無菌EP管中依次加入50 μL無血清Opti-MEM培養液、轉染試劑Lipo3000(LipofectamineTM3000 Transfection Reagent，Thermo，L3000001)3 μL及去內毒素的重組質粒1 μg，輕柔混勻，室溫作用5 min；向EP管中加入P3000 (LipofectamineTM3000 Transfection Reagent，Thermo，L3000001)2 μL，輕柔混勻，室溫作用20 min；清洗IPEC-J2細胞單層，每孔加入150 μL無血清的DMEM培養液，并向孔板中均勻滴加轉染試劑。轉染 24 h收集細胞，再通過以鼠抗HA標簽單抗為一抗的免疫熒光法(IFA)和以小鼠抗Nsp6多抗為一抗的Western blot檢測法來判定Nsp6及截短蛋白在細胞中的表達情況。

1.6 PEDV Nsp6蛋白的純化及多克隆抗體的制備

取200 mL誘導后的重組大腸桿菌pSUMO-Nsp6/Rosetta菌液，按照1.4所述方法制備蛋白樣并進行SDS-PAGE；電泳結束后，將凝膠放入提前配制好的低溫KCl溶液中染色10 s，使用刀片切下白色的目的帶并將其放入含2 mL電泳緩沖液的透析袋中浸沒；正向100 V電泳2 h后，再反向電泳10 min，使蛋白從膠中析出；取出剩余膠條，將透析袋浸沒于1×PBS中，4 ℃平衡12 h；收集透析袋中溶液獲得純化的目的蛋白。

每100 μg純化的PEDV Nsp6蛋白與100 μL弗氏完全佐劑混合，充分乳化后分別在第0、7和14天按每只50、50和100 μg的劑量腹腔注射免疫4周齡BALB/c小鼠。第3次免疫完成后7 d，采集小鼠血清，并采用間接ELISA方法測定血清抗體效價。以PEDV CH/HLJ/18株細胞培養毒包被酶標板，封閉后，按照1∶20、1∶40、1∶80……1∶20 480倍比稀釋待檢血清并孵育，再添加辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG作為二抗，加入顯色液作用后終止反應，并用全波長酶標儀讀取各孔OD450 nm值。不同稀釋度血清與陰性對照OD值比值(P/N)≥2的最大稀釋度判定為血清抗體的效價。

1.7 鼠抗PEDV Nsp6蛋白多克隆抗體的特異性檢測

通過Western blot首先驗證鼠抗PEDV Nsp6蛋白多克隆抗體與Nsp6蛋白的結合情況。先將純化的Nsp6蛋白樣轉印至PVDF膜，加入1∶200稀釋的多克隆抗體孵育后再加入HRP標記山羊抗鼠IgG作為二抗，最后進行ECL顯色。為檢測多克隆抗體與PEDV培養物結合的情況，將PEDV細胞培養物及IPEC-J2細胞蛋白樣轉印至PVDF膜，按1∶200加入稀釋后的多克隆抗體孵育，再加入HRP標記山羊抗鼠IgG作為二抗，最后進行ECL顯色。

2 結果

2.1 目的基因的擴增及重組質粒的鑒定

提取PEDV的RNA，并反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，擴增Nsp6基因片段并將其構建到重組質粒pSUMO-Nsp6，經過PCR鑒定，可獲得大小為840 bp的目的條帶(圖1A)。再利用限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ進行雙酶切鑒定，可以獲得大小約為5 598 bp的載體片段及大小約為840 bp的目的條帶(圖1B)。

M1.DNA Marker DL2000；1.pSUMO-Nsp6 PCR鑒定結果；2.陰性對照；M2.DNA Marker DL8000；3.pSUMO-Nsp6 BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。

以pSUMO-Nsp6質粒為模板，利用EcoRⅠ及XhoⅠ切割下Nsp6并連接至pCMV-HA真核表達載體上，獲得重組質粒pCMV-Nsp6。根據SMART網站對Nsp6功能域的預測，將Nsp6基因分為3段，分別連接到pCMV-HA真核表達載體上，構建出pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2和pCMV-Nsp6-3三種重組質粒，并進一步進行PCR鑒定，獲得長度分別為840、258、210 和402 bp的目的片段(圖2A)；再次經過限制性內切酶進行單、雙酶切鑒定后獲得相應大小的目的片段(圖2B)。

M1.DNA Marker DL2000；1.陰性對照；2.pCMV-Nsp6 PCR鑒定；3.pCMV-Nsp6-1 PCR鑒定；4.pCMV-Nsp6-2 PCR鑒定；5.pCMV-Nsp6-3 PCR鑒定；M2.DNA Marker DL8000；6.pCMV-Nsp6 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定；7.pCMV-Nsp6 EcoRⅠ單酶切鑒定；8.pCMV-Nsp6 XhoⅠ單酶切鑒定；9.pCMV-Nsp6-1 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定；10.pCMV-Nsp6-1 EcoRⅠ單酶切鑒定；11.pCMV-Nsp6-1 XhoⅠ單酶切鑒定；12.pCMV-Nsp6-2 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定；13.pCMV-Nsp6-2 EcoRⅠ單酶切鑒定；14.pCMV-Nsp6-2 XhoⅠ單酶切鑒定；15.pCMV-Nsp6-3 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定；16.pCMV-Nsp6-3 EcoRⅠ單酶切鑒定；17.pCMV-Nsp6-3 XhoⅠ單酶切鑒定。

2.2 Nsp6蛋白原核表達及純化鑒定

將鑒定正確的重組菌pSUMO-Nsp6/Rosetta進行大量培養，用IPTG誘導蛋白表達。經SDS-PAGE分析后結果如圖3A所示，誘導后菌體和超聲后菌體沉淀及上清液中，在47 kDa處可見目的蛋白表達條帶。以帶His標簽的單克隆抗體為一抗通過Western blot對其進一步鑒定，結果表明可在正確位置出現特異性條帶(圖3B)。

M.蛋白Marker；1.誘導后上清液；2.誘導12 h菌體；3.誘導12 h超聲后沉淀，4.誘導12 h超聲后上清液；5.誘導前菌體沉淀；6～7.純化的Nsp6蛋白；8.空載體對照。

2.3 鼠抗Nsp6多克隆抗體的鑒定及效價的測定

將純化的Nsp6蛋白免疫小鼠，3次免疫后收集小鼠血清。為了驗證所制多抗是否能夠與Nsp6蛋白相結合，利用Western blot法分別檢測含有SUMO標簽的Nsp6蛋白及PEDV病毒培養物中的Nsp6蛋白與制備的鼠抗PEDV Nsp6多克隆抗體的結合情況，結果如圖4所示，分別檢測到約為47 kDa大小的含SUMO標簽的Nsp6及約為32 kDa大小的PEDV Nsp6 蛋白條帶，說明所制多抗能夠與含SUMO標簽的Nsp6蛋白和PEDV的Nsp6蛋白相結合。利用間接ELISA檢測免疫小鼠血清抗體效價，結果如圖5所示，P/N≥2時，血清最大稀釋比例為 1∶10 240，即制備的鼠抗Nsp6多克隆抗體的效價為1∶10 240。

M.蛋白Marker；1.純化的Nsp6蛋白(含SUMO標簽)；2.空白細胞對照；3.PEDV培養物中Nsp6蛋白。

圖5 間接ELISA方法檢測鼠抗Nsp6多克隆抗體效價

2.4 Nsp6截短片段的真核表達及鑒定

為確定連接真核表達載體的Nsp-6及其截短蛋白在IPEC-J2細胞中的表達情況，首先利用IFA檢測Nsp6及各截短片段轉染至IPEC-J2細胞中的表達情況，結果如圖6A所示。以鼠抗HA標簽抗體作為一抗，FITC標記山羊抗小鼠IgG作為二抗，轉染后4種質粒均可在IPEC-J2細胞中檢測到綠色熒光，表明目的蛋白獲得表達。再利用Western blot檢測pCMV-Nsp6、pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2、pCMV-Nsp6-3在IPEC-J2細胞中的表達，結果如圖6B所示。在鼠抗Nsp6多克隆抗體的作用下，分別在32、10.6、8.7和15 kDa的位置檢出符合預期大小的蛋白條帶，表明4種蛋白在IPEC-J2細胞中均獲得表達。

M.蛋白Marker；1.Nsp6；2、6.細胞對照；3.Nsp6-1；4.Nsp6-2；5.Nsp6-3。

3 討論

PEDV是具有囊膜的單鏈正向RNA病毒，其RNA基因組大小約為28 kb[6]。PEDV基因組編碼4種結構蛋白：刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)，以及16種非結構蛋白(Nsp1～Nsp16)和輔助蛋白ORF3[7]。非結構蛋白是冠狀病毒復制和形成轉錄復合物(RTC)以及逃避免疫系統的關鍵要素。通過劫持內質網膜，Nsps幫助病毒建立RTC[8]。目前對于與PEDV同屬冠狀病毒成員SARS-CoV2的研究表明，Nsp6蛋白也能夠引起細胞自噬[9]。Cottam 等[10]發現Nsp6可以誘導宿主細胞中的內質網形成自噬體。通過突變Nsp6可以導致SARS-CoV-2的毒性降低，從而影響病毒的致病性[11]。對以傳染性支氣管炎病毒為代表的禽冠狀病毒研究也證明了Nsp6損害了由饑餓誘導的自噬溶酶體的形成[12]，進一步證明了Nsp6蛋白對自噬的復雜調節作用。Nsp6、Nsp1及Nsp12蛋白具有干擾素拮抗作用[13]。此外，Nsp6能夠與TANK激酶1(TBK1)結合并在不影響TBK1的磷酸化的基礎上抑制IRF3的磷酸化，從而減少Ⅰ型干擾素的產生[14]。Nsp6和Nsp13能夠通過抑制信號轉導和轉錄激活因子1和2(STAT1和STAT2)的磷酸化進而抑制干擾素信號的傳導[15]。

Nsp6 在PEDV感染IPEC-J2細胞的過程中也對誘發細胞自噬產生重要的作用[4]，然而目前針對Nsp6蛋白引起細胞自噬產生的具體功能域研究則鮮有報道。為進一步確定Nsp6蛋白誘導細胞自噬產生的關鍵功能域，本試驗通過SMART網站對Nsp6蛋白的潛在結構域進行預測，評估了蛋白可能的跨膜區域。在盡量不破壞其原有的結構域基礎上，將Nsp6基因分段為3段，分別構建真核表達質粒，并轉染至IPEC-J2細胞中表達。

為確定Nsp6及其分段基因的真核表達情況，本試驗構建重組原核表達質粒pSUMO-Nsp6，并將其在大腸桿菌中原核表達，獲得的蛋白用于制備抗Nsp6 蛋白的多克隆抗體。Western blot結果表明，該抗體既可以與含SUMO標簽的Nsp6原核表達蛋白結合，又可以與PEDV的天然Nsp6蛋白相結合，說明該抗體能夠用于識別PEDV，且通過Western blot確定了Nsp6及其分段基因在IPEC-J2細胞中均得到了表達。

總之，本文為進一步確定Nsp6蛋白誘導細胞自噬的關鍵功能域做好了鋪墊，為闡明PEDV在感染宿主上皮細胞IPEC-J2過程中的分子機制提供理論基礎，對深入了解PEDV的致病機理提供重要線索，也為研究PEDV的抗病毒藥物提供重要的靶點。