牛支原體黏附相關(guān)因子的研究進(jìn)展

楊舒婷，李媛，王茗雨，檀雅潔，梁家豪，荊婷婷，2，付磊，2，儲(chǔ)岳峰，2*

(1.蘭州大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

養(yǎng)牛業(yè)是畜牧業(yè)的重要組成部分，牛肉、牛奶及乳制品是人們飲食生活中的重要品種。確保牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，不僅是保障食品安全和畜牧業(yè)安全的重要條件，也是對(duì)鞏固脫貧攻堅(jiān)成果、促進(jìn)鄉(xiāng)村振興的有力支撐，更是促進(jìn)我國(guó)西部地區(qū)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素。牛支原體病目前在世界范圍內(nèi)流行，是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)牛業(yè)的重要疫病之一，給養(yǎng)牛業(yè)造成不可估量的損失[1]。1961年美國(guó)首次分離到牛支原體(Mycoplasmabovis)，之后卻未引起重視，同時(shí)，因?qū)嶒?yàn)工具與技術(shù)的局限性，對(duì)牛支原體研究較為滯后。我國(guó)華中地區(qū)自2008年暴發(fā)牛“爛肺病”以來(lái)，現(xiàn)已在全國(guó)廣泛流行，牛支原體是重要病原之一，可引起患牛肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎等一系列重要疾病，但由于對(duì)牛支原體致病因子缺乏了解，致病機(jī)制仍不清楚，迄今無(wú)安全有效的商業(yè)化疫苗可用，也是牛支原體病難以有效防控的重要原因。

牛支原體與其他支原體類似，基因組很小、細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，缺乏依靠自身合成氨基酸、核苷酸等一系列必需物質(zhì)的能力，且體外培養(yǎng)支原體的要求相較于一般細(xì)菌會(huì)更高，因此，牛支原體必需與宿主細(xì)胞取得直接聯(lián)系以維持生存[2]。由于牛支原體沒(méi)有細(xì)胞壁，黏附宿主細(xì)胞的功能就由其細(xì)胞膜及相關(guān)膜蛋白承擔(dān)，因此，表達(dá)在細(xì)胞膜上的黏附因子對(duì)于支原體的黏附宿主細(xì)胞作用十分重要[3]。已有研究表明，肺炎支原體與雞毒支原體的非黏附分離株和突變株的毒力減弱，也證明黏附是支原體致病的重要毒力因素[4]。

闡明牛支原體的黏附機(jī)制有助于更清晰地了解牛支原體的感染途徑以及致病機(jī)理，有利于新型防控產(chǎn)品的研發(fā)，有效防制因牛支原體感染引起的呼吸道等疾病的暴發(fā)，減少養(yǎng)殖戶在養(yǎng)牛業(yè)上的經(jīng)濟(jì)損失，有助于保障我國(guó)尤其是西部地區(qū)畜牧業(yè)的安全、健康發(fā)展。本文將基于牛支原體黏附和牛支原體致病機(jī)理研究現(xiàn)狀，論述牛支原體黏附相關(guān)因子的研究進(jìn)展。

1 黏附機(jī)制在牛支原體致病中發(fā)揮的作用

黏附是牛支原體進(jìn)入宿主細(xì)胞的第一步，并會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。支原體在代謝過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)氧化氫等物質(zhì)，能給宿主細(xì)胞膜造成氧化性損傷，甚至使細(xì)胞死亡[5]。細(xì)菌黏附因子的靶蛋白主要是宿主細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組分，包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、層粘連蛋白等[6]。對(duì)于支原體，位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)可以與宿主細(xì)胞的ECM成分結(jié)合，例如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、纖溶酶原和糖胺聚糖肝素，從而介導(dǎo)支原體定殖或侵襲[7]。因牛支原體沒(méi)有細(xì)胞壁，細(xì)胞膜及膜相關(guān)蛋白往往直接參與黏附宿主細(xì)胞[8]。而膜蛋白和糖脂是細(xì)胞膜上的主要抗原，可刺激宿主產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[9]。總之，牛支原體通過(guò)細(xì)胞膜表面蛋白或者黏附蛋白與宿主細(xì)胞上的靶蛋白(如纖連蛋白、纖溶酶原、肝素和淀粉樣蛋白前體樣蛋白-2[10])黏附，從而介導(dǎo)牛支原體對(duì)宿主細(xì)胞的黏附。

已有研究表明，感染牛支原體將影響宿主免疫系統(tǒng)，其中包含炎癥因子的產(chǎn)生或免疫細(xì)胞的凋亡，而膜蛋白在調(diào)節(jié)宿主防御系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用[11]。支原體黏附到宿主細(xì)胞之后，能與宿主細(xì)胞膜形成緊密的直接接觸，這會(huì)造成局部膜融合。膜融合會(huì)使宿主細(xì)胞膜組分改變，如各種受體，直接影響機(jī)體正常的信息傳遞過(guò)程。另外，膜融合會(huì)使支原體內(nèi)部物質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞，包括有活性的酶，有極大可能直接影響宿主細(xì)胞正常的代謝活動(dòng)，如支原體磷蛋白磷酸酶進(jìn)入真核細(xì)胞后干擾其正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。牛支原體侵入不同細(xì)胞可能導(dǎo)致病原體傳播到各種定殖位點(diǎn)，這與削弱抗生素的治療效果和逃避免疫系統(tǒng)殺傷有關(guān)。部分支原體還可能破壞宿主的細(xì)胞膜，支原體與宿主細(xì)胞膜的緊密接觸可能引起宿主細(xì)胞磷脂的水解，還可能會(huì)引起特定的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，甚至?xí)尫拍苤录?xì)胞死亡的溶血磷脂。牛支原體黏附在宿主細(xì)胞上會(huì)掠奪宿主的營(yíng)養(yǎng)物資，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞的凋亡。

2 牛支原體的黏附因子

支原體在入侵細(xì)胞時(shí)，必不可少的過(guò)程是進(jìn)行黏附。牛支原體的黏附能力很強(qiáng)，可以黏附于宿主的不同細(xì)胞。在研究牛支原體的黏附中，以胎牛肺細(xì)胞(EBL)最為常見(jiàn)，除此之外，牛氣管上皮細(xì)胞 (BBE)、胚胎牛氣管細(xì)胞 (EBTr)、牛腎細(xì)胞(MDBK)和兔腎細(xì)胞 (RK)等在研究中也常被用為宿主細(xì)胞。牛支原體的黏附作用是通過(guò)其表面結(jié)構(gòu)與宿主細(xì)胞的表面受體相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。牛支原體沒(méi)有具有黏附作用的尖端細(xì)胞器[12]，它的黏附因子被認(rèn)為以膜蛋白的形式散布在菌體表面[13]，下面就其黏附因子進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

2.1 P26蛋白

1992年，Berthold等[14]使用牛支原體J282來(lái)篩選單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)識(shí)別26 kDa蛋白的單克隆抗體4F6有很強(qiáng)的特異性，可以與該試驗(yàn)中所有的牛支原體反應(yīng)。1993年，Sachse等[15]發(fā)現(xiàn)4F6可以特異性阻斷牛支原體對(duì)EBL細(xì)胞的黏附，這種針對(duì)26 kDa蛋白的單克隆抗體可以使牛支原體對(duì)EBL細(xì)胞的黏附力降低。這些結(jié)果提示P26蛋白可能在牛支原體黏附中發(fā)揮作用，但目前還沒(méi)有鑒定到P26蛋白的靶蛋白。

2.2 P27蛋白

據(jù)報(bào)道，牛支原體中一種假設(shè)的脂蛋白P27具有黏附素活性[16]。P27分布在整個(gè)支原體細(xì)胞中，但大部分P27分子都暴露在膜表面。免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和特異性血清阻斷試驗(yàn)表明，P27可以直接黏附到EBL細(xì)胞上，并且這種結(jié)合可以被抗P27血清特異性阻斷。進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)P27的靶蛋白是纖連蛋白，它們之間的相互作用是直接和特異的，呈劑量依賴性。經(jīng)過(guò)基因組比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)幾乎所有牛支原體的臨床分離株都具有p27基因[17]。

2.3 P33蛋白

2014年，吳金迪等[18]對(duì)牛支原體全基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)約33 ku的具有黏附特征的假定蛋白，命名為P33蛋白。P33蛋白定位于牛支原體細(xì)胞膜表面，可以黏附EBL細(xì)胞，其吸附作用被P33抗體特異性抑制，表明P33是牛支原體中一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的具有黏附作用的膜表面相關(guān)蛋白。2019年，根據(jù)p33基因序列設(shè)計(jì)并合成特異性引物，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/P33，并獲得純度較高的P33重組蛋白，特異性好。該重組蛋白為后續(xù)開(kāi)展牛支原體檢測(cè)方法及疫苗的研究奠定基礎(chǔ)[19]。遺憾的是，研究沒(méi)有確定P33蛋白的靶蛋白。

2.4 膜表面可變脂蛋白家族蛋白(Vsps)

表面可變脂蛋白Vsps家族是牛支原體在黏附宿主細(xì)胞的過(guò)程中產(chǎn)生了表面可塑性后，演化出的針對(duì)特定抗體的蛋白，在黏附過(guò)程中，此類蛋白可在一定程度上幫助牛支原體抗原躲避宿主細(xì)胞免疫防御系統(tǒng)，從而便利牛支原體進(jìn)一步入侵細(xì)胞，在病原體與真核細(xì)胞的相互作用、抗原變異和免疫逃避中起著至關(guān)重要的作用。該家族成員主要具有以下特點(diǎn)：(1)N端部分含有原核脂蛋白信號(hào)序列；(2)表面暴露的C端區(qū)域帶有廣泛的重復(fù)結(jié)構(gòu)；(3)自發(fā)非坐標(biāo)相位變化率高；(4)高頻蛋白大小變化；(5)通過(guò)N末端半胱氨酸殘基處的脂質(zhì)部分將這些大量表達(dá)的可變性蛋白錨定在支原體膜中[20]。Vsp蛋白的所有氨基端都有一個(gè)保守的原核信號(hào)肽，同源性超過(guò)99%，Vsp蛋白也可以通過(guò)氨基末端錨定在細(xì)胞膜上[21]。Thomas等[22]發(fā)現(xiàn)，識(shí)別VspC和VspF的單克隆抗體可以抑制牛支原體對(duì)BBE細(xì)胞的黏附，表明VspC和VspF可能是黏附因子。Sachse等[23]對(duì)牛支原體的VspA、VspB、VspE和VspF進(jìn)行研究，其競(jìng)爭(zhēng)性黏附試驗(yàn)表明，VspA、VspB、VspE和VspF的不同重復(fù)單位產(chǎn)生的一些寡肽部分抑制了牛支原體PG45菌株對(duì)胎牛肺細(xì)胞的黏附。由此表明牛支原體Vsps也是其重要的黏附因子。遺憾的是，這些研究都沒(méi)有確定這些Vsps黏附素的靶蛋白。

2.5 α-烯醇化酶和果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(FBA)

已有研究表明，一些胞質(zhì)代謝酶或管家酶可以定位在病原體的表面并發(fā)揮多種功能，如一些細(xì)菌代謝酶出現(xiàn)在細(xì)胞膜上時(shí)可以介導(dǎo)宿主-病原體的相互作用，讓病原菌定殖在細(xì)胞上[24]。α-烯醇化酶又稱2-磷酸-D-甘油酸水解酶，它催化磷酸甘油轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸，是糖酵解的限速酶之一。它是一種高度保守的蛋白[25-26]，廣泛存在于多種細(xì)菌表面。牛支原體膜蛋白結(jié)合纖溶酶原的能力與其存在的α-烯醇化酶密切相關(guān)[27]。Song等[28]對(duì)牛支原體的α-烯醇化酶蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它具有纖溶酶原結(jié)合活性，而纖溶酶原可以顯著增強(qiáng)牛支原體黏附EBL的能力；且抗牛支原體α-烯醇化酶的抗體會(huì)特異性地抑制此種黏附能力，證實(shí)了α-烯醇化酶在牛支原體黏附過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

同樣，F(xiàn)BA也在糖酵解過(guò)程中起重要作用，但其生物學(xué)功能遠(yuǎn)不止于此。FBA是糖酵解、糖異生和三羧酸循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶[29]，是多種致病菌中的一種多功能蛋白，是在牛支原體細(xì)胞膜上表達(dá)的一種免疫原性蛋白[30]。通過(guò)Western blot和ELISA證實(shí)FBA的目的蛋白為纖溶酶原。Huang等[31]通過(guò)Western blot和IFA進(jìn)一步的亞細(xì)胞定位研究證明，F(xiàn)BA主要聚集在牛支原體的細(xì)胞質(zhì)中，也有一些在細(xì)胞膜上，并且純化的rFBA與天然的FBA一樣具有醛縮酶活性，這表明FBA在牛支原體中具有多種作用。通過(guò)EBL細(xì)胞的黏附和抑制試驗(yàn)，證實(shí)rFBA可以直接黏附于EBL細(xì)胞，并且用rFBA的多克隆抗體預(yù)孵育牛支原體后，可以顯著降低牛支原體對(duì)EBL細(xì)胞的黏附效率，這再次表明牛支原體中的FBA是一種黏附素，跟牛支原體的毒力相關(guān)。

2.6 VpmaX蛋白

對(duì)牛支原體Hubei-1株的基因組分析發(fā)現(xiàn)，在該菌株的基因組中有一個(gè)注釋為VspA的基因，但該基因的編碼蛋白與PG45標(biāo)準(zhǔn)菌株的VspA蛋白完全不同，該基因被命名為VpmaX[32]。VpmaX蛋白含229個(gè)氨基酸，分子量約為35 kDa。該蛋白具有1個(gè)典型的原核信號(hào)肽和2個(gè)重復(fù)單元，其中大單元重復(fù)3次，小單元重復(fù)7次，且該結(jié)構(gòu)與Vsp家族蛋白類似。該蛋白是一種具有纖連蛋白結(jié)合特性的黏附相關(guān)蛋白，能通過(guò)EBL細(xì)胞外基質(zhì)成分纖連蛋白介導(dǎo)其黏附EBL細(xì)胞[33]。同樣，這種對(duì)EBL細(xì)胞的黏附作用可被抗VpmaX血清阻斷[34]，表明牛支原體Hubei-1株中的VpmaX蛋白也是一種黏附素分子。

2.7 P41蛋白

牛支原體Hubei-1株p41基因和p41b基因分別編碼一個(gè)32 ku的蛋白P41及一個(gè)17 ku的蛋白P41b。其中P41b蛋白是P41蛋白的C端截短體。P41是牛支原體的一種膜蛋白，對(duì)EBL細(xì)胞具有明顯的黏附現(xiàn)象，該蛋白黏附效率與蛋白濃度呈正相關(guān)。而P41蛋白發(fā)揮其黏附性的為其蛋白結(jié)構(gòu)的C端。且這種黏附作用可被不同稀釋度的抗體不同程度的抑制，抑制程度也與抗體濃度成正比。同時(shí)，相對(duì)應(yīng)的兔源抗體對(duì)牛支原體的黏附過(guò)程也起著阻斷作用，證實(shí)了P41蛋白是牛支原體的黏附相關(guān)蛋白，對(duì)EBL細(xì)胞具有明顯的黏附作用[35]。但該蛋白是否具有纖溶酶原或纖連蛋白結(jié)合特性尚不清楚，有待通過(guò)相關(guān)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

2.8 NADH氧化酶

NADH氧化酶(NOX)是一類催化NADH氧化為NAD+的氧化還原酶，由NOX基因編碼，該蛋白質(zhì)含有454個(gè)氨基酸，分子量為49 kDa[36]。根據(jù)產(chǎn)物的不同，可將NOX分為兩類：一類為產(chǎn)H2O2型NADH氧化酶(NOX-1)，另一類為產(chǎn)H2O型NADH氧化酶(NOX-2)[37]。除催化作用以外，某些生物NADH氧化酶還具有其他的功能。牛支原體NOX-1與NOX-2均參與其對(duì)宿主細(xì)胞的黏附。NOX 可以特異性黏附淀粉樣蛋白前體樣蛋白-2和纖連蛋白。NOX-1在牛支原體細(xì)胞膜上和細(xì)胞漿中均有分布且胞漿中含量較高[38]。牛支原體中的NOX-2蛋白是一種膜蛋白抗原，其抗體可介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒性殺支原體作用，并可抑制支原體對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，可能與支原體的免疫應(yīng)答和感染相關(guān)[39]。

2.9 核糖焦磷酸激酶(prsA)

prsA蛋白是一種新鑒定的牛支原體膜蛋白，可能參與牛支原體與宿主細(xì)胞間的相互作用。prsA蛋白存在于牛支原體細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，具有黏附的特性。該蛋白的血清抗體具有殺牛支原體活性。prsA蛋白可能參與牛支原體對(duì)宿主細(xì)胞的感染，但該蛋白是否具有纖溶酶原或纖連蛋白結(jié)合特性尚不清楚，有待通過(guò)相關(guān)研究進(jìn)行驗(yàn)證[40]。

2.10 丙酮酸脫氫酶(PDE)

PDE是由3個(gè)酶組合的復(fù)合體，負(fù)責(zé)催化丙酮酸脫羧，生成乙酰輔酶A的不可逆反應(yīng)，分布在線粒體基質(zhì)中，是連接糖酵解與脂代謝、糖異生及三羧酸循環(huán)的重要媒介。滑液支原體中丙酮酸脫氫酶α亞基在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，其原核表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶酶原和纖連蛋白結(jié)合活性，且丙酮酸脫氫酶α亞基兔多抗能有效激活補(bǔ)體并能抑制滑液支原體對(duì)宿主細(xì)胞DF-1的黏附作用[41]。對(duì)丙酮酸脫氫酶α亞基與丙酮酸脫氫酶β亞基基因序列進(jìn)行擴(kuò)增、分析發(fā)現(xiàn)與其他已報(bào)道的相關(guān)序列具有較高的相似性，E1亞基和E1β亞基的表面可及性與抗原指數(shù)均較高，證實(shí)丙酮酸脫氫酶E1亞基可被呈遞至牛支原體細(xì)胞膜，并具有一定的黏附特性[42]。

2.11 其他黏附因子

迄今為止，已鑒定出數(shù)十種參與牛支原體黏附的蛋白，除上述蛋白外，富含亮氨酸鏈重復(fù)序列的脂蛋白[43]、TrmF0[44]、支原體免疫原性脂肪酶A[45]、24 kDa蛋白[46]、Mbov_0503編碼蛋白[47]等也是與牛支原體黏附作用相關(guān)的分子。

3 小結(jié)與展望

牛支原體對(duì)于不同年齡的牛都具有感染性，并能與其他病原菌混合與繼發(fā)感染，共同作用造成牛患病更加嚴(yán)重[48]，其中，黏附在牛支原體入侵感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中起了重要作用，也將對(duì)宿主細(xì)胞造成損傷。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的較為重要的黏附相關(guān)因子有P26蛋白、P33蛋白、Vsps、α-烯醇化酶和FBA、VpmaX蛋白、P41、NOX、prsA等，這些黏附因子通過(guò)與宿主細(xì)胞相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)牛支原體的黏附入侵，不同黏附因子與宿主細(xì)胞上的作用與分子機(jī)制有所不同。牛支原體的發(fā)現(xiàn)時(shí)間雖然已經(jīng)超過(guò)了60年，但研究的程度并不深入。目前，針對(duì)感染牛支原體而造成的疾病臨床治療效果不佳，市面上并未有針對(duì)牛支原體的疫苗，且對(duì)于不同抗生素低敏感甚至產(chǎn)生耐藥性的菌株不斷出現(xiàn)[49]。基于這些情況，完全闡釋牛支原體黏附因子及黏附作用機(jī)制，有利于全面解析其致病機(jī)制，從而加快研發(fā)能靶向牛支原體黏附因子的抗生素藥物或小分子制劑，以及基于支原體免疫抗原的發(fā)掘而快速研發(fā)有效疫苗，能極大地減少因感染牛支原體而造成的經(jīng)濟(jì)損失，有利于我國(guó)特別是西部地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，為全國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展以及促進(jìn)鄉(xiāng)村振興提供助力。