2株鴨源H10N6亞型禽流感病毒的遺傳進化分析及其致病性研究

朱峻鋒，劉朔，尹馨，彭程，劉華雷，蔣文明，3*，張傳美*

(1.青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266032；3.農業農村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室(南方)，山東 青島 266032)

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)是正黏病毒科、A型流感病毒屬，一般僅感染禽類，有些AIV能越過物種界限進行擴散，并引起人類及其他哺乳動物的疾病或亞臨床感染[1-3]。依據AIV在SPF雞中致病性，可以將其分為高致病性AIV與低致病性AIV兩種類型[4]。

目前，在野生水禽中已經鑒定出16種血凝素(HA)和9種神經氨酸酶(NA)亞型，并從蝙蝠體內發現了H17N10、H18N11兩種亞型[3]。1949年H10N7亞型AIV在德國雞群中首次分離。隨后，在許多鳥類、哺乳類動物中均有不同程度的分布，其中包括家雞、水貂等。之后，H10亞型AIV在各國家禽及野鳥間蔓延傳播，并且在此期間病毒不斷地重組導致宿主范圍不斷擴大[5]。瑞典于1984年報道了H10N4亞型AIV感染了哺乳動物雪貂，造成大批死亡，且結果發現，病毒PB2蛋白出現K526R與D701N的哺乳動物適應性相關突變現象[6]。2003年從我國湖北省豬體內首次分離出H10N5亞型AIV[7]。2010年，澳大利亞報道了多例臨床癥狀明顯的人感染H10N7病毒病例[8]。2013年在我國江西省首次出現人類感染H10N8亞型AIV死亡案例，感染試驗結果顯示，病毒可在小鼠肺組織中高效復制[9]。多項研究表明，H10亞型AIV可以跨物種侵染哺乳動物并有可能進一步發生適應性突變，對人類健康構成威脅。2021年4月江蘇省報告了第1例人感染H10N3亞型禽流感病毒案例，研究表明這種新型重組病毒對小鼠具有高致病性，存在人類感染的風險[10]。

持續監測、了解和探索已知和新型AIV并評估其對動物和人類健康的潛在影響是疫病防控的前提。本實驗室在2020年全國主動流行病學調查中，在鴨的口咽拭子中分離到2株H10N6亞型AIV，對這2株分離到的病毒進行了全基因組測序、遺傳演化分析及動物感染試驗，分析該病毒的生物學特性，評估該病毒的公共衛生風險，以期對國內H10亞型禽流感綜合防治工作有所借鑒。

1 材料與方法

1.1 病毒及實驗動物

A/duck/Fujian/F1464/2020(H10N6)(簡稱F1464)、A/duck/Fujian/F1473/2020(H10N6)(簡稱F1473)由中國動物衛生與流行病學中心分離鑒定并保存；6周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司；6周齡SPF雞和SPF雞胚均購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 主要試劑

病毒核酸提取試劑盒購自濟凡生物科技(常州)有限公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA膠純化試劑盒購自索萊寶公司。

1.3 病毒全基因組測序及遺傳演化分析

根據病毒RNA提取試劑盒的說明書，對2株H10N6亞型AIV進行RNA提取，以它為模板，參照Hoffmann等[11]的引物和反應條件，分別用RT-PCR方法擴增基因組中各個目的節段。在此基礎上通過比較不同核酸片段大小和長度來判斷該樣品是否為禽流感病毒樣本。對擴增產物進行純化、測序和鑒定。測序結果采用DNAStar軟件Seqman Pro拼接序列。

下載GenBank和GISAID數據庫中AIV基因組序列，在MEGA 11.0中用Clustal W法比較病毒各基因片段序列，通過Neighbor-Joining構建了8條基因片段遺傳進化樹，Bootstrap值設置為1 000。

1.4 病毒純化和雞胚半數感染量(EID50)測定

2株病毒用PBS按10倍倍比稀釋，稀釋度為10-6～10-9，接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度分別接種5次。37 ℃孵育48 h后，收集稀釋度最大、血凝價最高的雞胚尿囊液，按照上述操作步驟，如此循環純化3代后，再將收集到的尿囊液進行分裝，-80 ℃凍存備用。使用時，取出-80 ℃保存的純化的含病毒尿囊液并10倍倍比稀釋，每個稀釋度分別接種5枚10日齡SPF雞胚并在37 ℃條件下孵化48 h，統計各稀釋度具有血凝活性的雞胚數，根據Reed-Muench法計算各毒株EID50。

1.5 靜脈接種指數(IVPI)測定

病毒在生理鹽水中10倍稀釋后，每羽SPF雞用0.1 mL稀釋后的病毒液進行翅下靜脈注射，每組10只，感染后對試驗雞的臨床癥狀和死亡情況進行持續10 d的觀察與記錄。IVPI為每只雞在10 d內的臨床觀察得分平均值，24 h內動物完全死亡為3分，10 d內動物完全無癥狀為0分，出現呼吸系統相關癥狀、精神沉郁、腹瀉、頭冠紫紅、頭面水腫、神經系統癥狀為1分。IVPI超過1.2，則判定為高致病性AIV[12]。

1.6 小鼠感染性試驗

6周齡雌性BALB/c小鼠經干冰麻醉后，用106EID50的病毒劑量通過鼻腔感染小鼠8只，每只接種50 μL尿囊液。在攻毒后14 d內，每天監測小鼠的疾病體征、體重變化(相對于攻毒前的體重變化)和死亡情況以初步鑒定該病毒對機體的影響。病毒感染后3 d，每組隨機選擇3只小鼠進行剖殺，分別取小鼠的腦、鼻甲、脾臟、腎臟和肺臟，用雞胚滴定各臟器內病毒含量。各種組織臟器經勻漿機勻漿后，2 000g離心10 min，將上清液轉移到滅菌離心管中，用含抗生素的無菌PBS進行10倍比稀釋，每個稀釋接種3枚10日齡的雞胚，根據Reed-Muench法計算病毒滴度，以測定病毒在小鼠體內各臟器的復制水平。

2 結果

2.1 鴨源H10N6亞型AIV的序列與遺傳演化分析

為了明確本研究中2株H10N6病毒的起源，首先對全基因組進行測序，并對HA和NA以及其他6個基因片段進行遺傳進化分析(圖1和圖2)。結果表明，2株H10N6病毒HA基因均屬于歐亞譜系。BLAST分析結果表明，這2株H10N6的HA基因與浙江毒株A/chicken/Zhejiang/102622/2016(H10N8)最相似，NA基因與A/duck/Vietnam/HN5894/2019(H4N6)的關系最為密切。

注：▲和■表示不同年份人感染的H10毒株；●為本試驗分離毒株，下同。

圖2 兩毒株PA、NP、M和NS基因片段遺傳進化分析

PB2、PB1、PA、M、NS、NP基因與2013年以來從中國、韓國、越南等國家的家禽中分離出的各種亞型AIV密切相關(表1)。HA序列分析結果顯示，2株H10N6亞型AIV的HA基因之間的同源性為99.8%，與2013年的人感染H10N8亞型AIV和2021年的人感染H10N3亞型AIV同源性分別為91.4%～91.5%和95.3%～95.4%。經由對上述試驗結果的分析，2株鴨源H10N6亞型AIV與2013年的H10N8亞型AIV有較遠的親緣關系，與2021年的H10N3亞型AIV親緣關系較近。

表1 2株H10N6亞型AIV各基因節段同源性分析

2.2 IVPI

2株H10N6亞型AIV靜脈感染SPF雞后，感染組10只雞在10 d內無任何可見臨床癥狀出現，因此判定F1473和F1464毒株的IVPI均為0，為低致病性AIV。

2.3 BALB/c小鼠致病性試驗

以106EID50的劑量將2株H10N6亞型AIV各感染8只小鼠，3 d后滴定不同臟器內的病毒滴度，結果顯示(圖3)，2株病毒在小鼠肺臟及鼻甲中的平均滴度分別為1.5 lg～4.5 lg EID50/mL和3.25 lg～6.92 lg EID50/mL，2株病毒在小鼠的大腦及腎組織中均未被發現。在14 d觀察期內，F1473毒株組與對照組相比小鼠體重上升較慢，而F1464毒株組在感染后4 d出現明顯的體重下降(圖4)。體重變化與臟器病毒滴定結果一致，F1464毒株組不僅在鼻甲和肺臟中的病毒滴度比F1473毒株組高，脾臟中也監測到病毒復制。

圖3 小鼠感染兩毒株3 d后各臟器病毒滴度

圖4 小鼠感染14 d內體重變化

3 討論

自1997年以來，H5和H7亞型禽流感引起了全世界的關注，不僅給養禽業造成巨大經濟損失，還導致了上千人的感染病例[13]。近年來，一些其他亞型的AIV也出現了人感染病例，如H10、H3等。H10亞型AIV的傳入對人類健康構成潛在威脅，其不斷重組和感染引起了人們對H10亞型AIVs的更多關注，但目前世界范圍內發現的H10N6亞型禽流感病毒樣本較少。

2020年，本實驗室在全國的主動流行病學調查中，從鴨體內分離出2株H10N6亞型AIV。遺傳進化和系統發育分析表明，這2株分離株屬于歐亞譜系，是由多個亞型的AIV重組而來。根據遺傳進化分析結果，這些重組最有可能發生在中國、越南和韓國，因為這2株H10N6亞型AIV的基因與中國、越南和韓國分離毒株親緣關系最近。可能是家禽體內H10N8流感病毒與越南的H4N6亞型AIV重組后，又繼續與其他流感病毒進行重組，并通過一系列重組獲得其他流感病毒的內部基因，提示這2株H10N6亞型AIV可能是由包括H1、H2、H3、H4、H9、H10和H11在內的多種AIV亞型重組而來，其原因可能是攜帶病毒的野鳥在東亞至澳大利亞的遷徙過程中與東亞其他國家的病毒發生了重組。由于來自野生鳥類的AIV很少直接感染人類，與其他家禽甲型流感病毒重組可能使它們具有某些基因特征從而感染人類。

BALB/c小鼠致病性試驗結果表明，2株H10N6亞型AIV可以感染小鼠，并在小鼠呼吸系統(肺臟和鼻甲)中有效復制，但均不能突破小鼠血腦屏障在其腦內增殖。病毒在多系統的復制和滴度的高低決定了毒株的致病力不同，F1464毒株的致病力強于F1473毒株，出現一過性的體重下降。這2株H10N6病毒在下呼吸道(肺)中復制的滴度高于上呼吸道(鼻甲)，說明病毒具備結合人樣受體的能力。

隨著病毒的不斷進化，H10亞型病毒可能會導致潛在的人類感染風險問題，因此應加強對H10亞型AIV的監測，逐步深化拓展對其生物學特性的相關研究，以此更好地服務于國內流感疫情防控和預警預報等工作。