液相色譜-串聯質譜法檢測豬糞便中除蟲脲的方法學研究

鄧潤輝，范麗萍，劉希望，秦哲，白莉霞，葛聞博，李世宏，李劍勇，董書偉，楊亞軍*

(1.榆林學院生命科學學院，陜西 榆林 719000；2.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所/農業農村部獸用藥物創制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

以家蠅(MuscadomesticaL.)為代表的蠅類衛生害蟲適應性和繁殖力強，在養殖場環境中易大量孳生，并傳播疾病、襲擾牲畜，給生產、生活及周圍環境造成較大影響[1-2]。目前，殺滅蠅類成蟲的常見藥物包括有機磷類、菊酯類等，一般毒性較大。當前，國內畜禽口服滅蠅蛆藥僅有可用于雞的環丙氨嗪(cyromazine)[3]，其可降解為三聚氰胺，存在一定風險。因此，在國內養豬業中，高效、安全、便捷的口服滅蠅蛆藥目前尚屬空白。

20世紀70年代，人們在合成除草劑時，意外發現苯甲酰苯脲類化合物可干擾節肢動物的發育，進而將該類化合物開發成防治植物多種害蟲及動物節肢類寄生蟲的產品[4-5]。除蟲脲(diflubenzuron，DFB)就是第一個被開發出來的商業化產品，因其對許多昆蟲類害蟲有殺滅特效，并且因對人及環境中其他動物的低毒性而被廣泛應用于農業[6]、林業[7]、畜牧業[8-9]和衛生[10]等領域的昆蟲類害蟲的防治。

幾丁質是昆蟲類動物外骨骼及其幼蟲表皮的主要成分，包括DFB在內的苯甲酰苯脲類殺蟲劑，可抑制幾丁質的合成[11-12]。不同于常規的動物用藥物，DFB混飼給藥后在動物腸道內穩定[13]，吸收較少，大部分經糞便以原形排出[14-15]，在體外發揮藥效。孳生于糞便中的蠅蛆攝入DFB后，其發育過程中的幾丁質合成將被阻斷，故不能正常蛻皮、成蛹、羽化，進而可達到控制養殖場中蠅類成蟲數量的目的。在德國、巴西、美國等國家，除蟲脲已被批準添加于牛、豬、羊、馬等動物飼料中，用于控制養殖環境中蠅蟲數量[16-17]。因此，檢測動物糞便中DFB的濃度，對于判定混飼給藥劑量是否合理、預測藥效等具有重要意義。

QuEChERS法是一種提取樣品中殘留藥物的前處理方法，具有快速、簡單、低成本、有效、可靠和安全等優點。將待測樣品均質后，加入有機溶劑提取，無機鹽促使有機溶劑鹽析分層，最后根據待測樣品性質選擇凈化劑以吸附雜質、凈化樣品。目前，QuEChERS法已廣泛應用于農藥、獸藥殘留的檢測[18-19]。本研究在糞便樣品的前處理過程中采用了此方法，結合液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)，以DFB-13C6為內標，參照《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》[20]進行了方法學考察，進而建立了豬糞便中DFB濃度的檢測方法，以期明確豬口服除蟲脲預混劑后，其活性成分DFB在糞便中的濃度，進而結合體外藥效試驗結果，制定較為合理的給藥方案，也將為日后的糞便存儲和堆肥過程中待測物的降解規律研究提供檢測技術。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Agilent 1200-6410A液相色譜-串聯三重四級桿質譜聯用儀(Agilent Technologies，美國)；數據采集與處理軟件為MassHunter；電子分析天平(Sartorius，德國)，感量分別為0.000 01 g和0.001 g；Multifuge X3R大容量低溫離心機(Thermo Scientific，美國)；Vortex-2 Genie渦旋混合器(Scientific Industries，美國)；KQ-600DE超聲波清洗器(舒美，中國昆山)。

1.2 藥品與試劑

除蟲脲標準品，純度99.8%，購于中國計量科學研究院，批號19001；除蟲脲內標DFB-13C6，購于WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH，批號31241403；甲醇(批號213443)、甲酸銨(批號144753)和甲酸(批號205775)均購于Fisher Scientific(質譜級)；乙腈(批號20210114)、無水乙酸鈉(批號20210902)和氯化鈉(批號20181226)均購于國藥集團化學試劑有限公司(分析純)；N-丙基乙二胺(PSA，批號12213024)和十八烷基硅膠(C18，粒度40 μm，批號12213012)均購于安捷倫科技有限公司；無水硫酸鎂(分析純，批號20071219)購于天津市巴斯夫化工有限公司；冰乙酸(分析純，批號20171121)購于天津市科密歐化學試劑有限公司；二甲基亞砜(DMSO，ACS Grade，批號520C032)購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 溶液制備

DFB標準儲備液：精密稱取除蟲脲標準品(99.8%)10 mg，加入1 mL DMSO，水浴超聲，以使完全溶解，完全轉入10 mL量瓶中，以質譜級甲醇稀釋并定容至刻度，即為質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，-20 ℃存放。移取DFB標準儲備液，以10% DMSO甲醇溶液稀釋至相應濃度，作為中間標準儲備液及標準工作溶液，-20 ℃存放。

DFB-13C6標準儲備液：稱取DFB-13C6約5 mg，以10% DMSO甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度為0.5 mg/mL的標準儲備液，-20 ℃存放。以10% DMSO甲醇溶液稀釋成質量濃度為100 μg/mL的內標工作溶液。

0.1%冰乙酸乙腈：取冰乙酸1 mL，以乙腈稀釋至1 000 mL，混勻，宜現用現配。

10% DMSO甲醇溶液：取DMSO 10 mL，以質譜級甲醇稀釋至100 mL，混勻。

1.4 豬糞便樣品的處理

稱取糞便樣品2 g(±0.02 g)于50 mL離心管，加入濃度為100 μg/mL的DFB-13C6內標工作溶液10 μL，加入2 mL水，渦旋2 min，以使糞便樣品完全分散，加入10 mL 0.1%冰乙酸乙腈溶液，加入1 g無水乙酸鈉和2 g氯化鈉，渦旋混勻2 min，室溫下水浴超聲處理30 min(40 kHz)，4 ℃條件下4 500g離心10 min；移取1 mL上層清液，加入1 mL乙腈，于裝有0.05 g PSA、0.1 g C18和0.15 g無水硫酸鎂的15 mL離心管中凈化，渦旋1 min，4 500g離心2 min，上清液過0.22 μm有機微孔濾膜后，進行LC-MS/MS測定。

1.5 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱(3 mm×50 mm，1.8 μm)(Agilent Technologies，美國)；流動相A為甲醇，流動相B為5 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)，梯度洗脫程序見表1；流速為0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.6 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，毛細管電壓為+4 000 V；噴霧器壓力為30 psi；干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流量(氮氣)為10 L/min；電子倍增器電壓增加值(ΔEMV)為+300 V，采用多離子反應監測模式(MRM)進行檢測。MRM參數見表2[21]。

表2 優化后的MRM參數及特征離子對

1.7 方法學驗證

1.7.1 選擇性

取不同豬場及豬舍的空白豬糞便樣品，加入10 μL濃度為100 μg/mL的內標工作液后，依1.4項下的方法進行處理、檢測，記錄目標分析物的色譜圖，以考察不同來源的基質對DFB檢測的干擾。

1.7.2 定量下限

稱取空白豬糞便樣品，加入10 μL濃度為100 μg/mL的內標和100 μL濃度分別為0.2和0.4 μg/mL 的DFB標準工作溶液，渦旋混勻，制備成對應濃度的DFB加標樣品，依1.4項下的方法進行處理、檢測，記錄色譜圖，計算DFB定量離子的信噪比(SNR)，結合準確度及精密度試驗結果，以確定方法的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.7.3 基質效應

稱取空白豬糞便樣品，加入2 mL水，依1.4項下的方法進行處理，移取1 mL上清液，加入1 mL乙腈；加入10 μL濃度為10 μg/mL的內標工作液，加入10 μL濃度分別為0.4和100 μg/mL的DFB標準工作溶液并凈化，配制成低、高濃度水平的處理樣品，每個濃度6個平行，依前法進行檢測，與相應濃度標準溶液的定量離子峰面積進行比較，分別計算DFB及內標的基質因子，進而計算經內標歸一化的基質因子[20]。考察6批不同來源的空白豬糞便樣品，以評價方法的基質效應。

1.7.4 線性范圍

準確移取標準儲備液適量，以乙腈為溶劑，配制DFB濃度分別為1 ng/mL至500 ng/mL(對應的加標樣品濃度為10 ng/g至5 000 ng/g)，內標濃度均為50 ng/mL的系列濃度混合標準工作溶液，依前法進行LC-MS/MS檢測，以DFB與內標濃度的比值為橫坐標(x)，以DFB與內標的定量離子的峰面積比值為縱坐標(y)，選取合適的加權方式，進行線性回歸。

1.7.5 準確度和精密度

稱取空白豬糞便樣品，加入10 μL濃度為100 μg/mL的內標和100 μL濃度分別為0.2、0.4、2、20、100 μg/mL的DFB標準工作溶液，配制成DFB濃度分別為10 ng/g(LOD)、20 ng/g(LOQ)及100 ng/g(低)、1 000 ng/g(中)和5 000 ng/g(高)不同添加水平的豬糞便加標樣品，依1.4項下的方法進行處理、檢測。每個濃度6個平行，考察方法的準確度、精密度在批內及批間的變異情況。以隨行標準曲線計算樣品中待測物的濃度；對于接近定量限的樣品，在必要時可采用單點校正法計算待測物濃度。

1.7.6 樣品穩定性

稱取空白豬糞便樣品，加入10 μL濃度為100 μg/mL的內標工作液和100 μL濃度分別為0.4和100 μg/mL的DFB標準工作溶液，制備成添加濃度分別為20 ng/g和5 000 ng/g的DFB加標樣品；將此于-20 ℃凍存后，室溫下融化，反復3次，考察凍融穩定性；將樣品處理后，進樣前于室溫條件下放置24 h，以考察樣品處理液的穩定性。

2 結果與分析

2.1 方法的選擇性

對DFB及內標的標準溶液(圖1)、不同來源的空白豬糞便樣品(圖2)、空白豬糞便加標樣品(圖3)以及給藥后的實際樣品(圖4)等進行處理并檢測。如圖2e所示，在DFB定量離子出峰的位置(保留時間Rt為5.08 min)，空白基質出現了較小的干擾；但其響應低于待測物DFB定量下限20 ng/g定量離子響應的20%(圖5b)，符合方法學要求[20]。表明該方法選擇性好，豬糞便基質對DFB的干擾在定量檢測可接受的范圍內。

a.總離子流圖TIC；b.317.10→141.10；c.317.10→158.10*；d.311.10→141.10；e.311.10→158.10*。

a.TIC；b.317.10→141.10；c.317.10→158.10*；d.311.10→141.10；e.311.10→158.10*。

a.TIC；b.317.10→141.10；c.317.10→158.10*；d.311.10→141.10；e.311.10→158.10*。

a.TIC；b.317.10→141.10；c.317.10→158.10*；d.311.10→141.10；e.311.10→158.10*。

2.2 定量下限

當空白豬糞便中DFB的添加濃度分別為10 ng/g和20 ng/g時，采用前述的樣品處理及檢測方法，DFB定量離子的SNR(以峰高對峰高的方式計算)分別大于3和10，符合定性和定量檢測的要求。典型的檢測圖譜見圖5。

a.LOD 10 ng/g，Rt 5.08 min，SNR 19.4；b.LOQ 20 ng/g，Rt 5.08 min，SNR 25.1。

2.3 基質效應

基質效應的考察結果如表3所示。結果顯示，方法的平均基質效應在97%～108%之間，且基質效應的批內和批間變異系數均小于10%，符合定量檢測要求[20]。

表3 DFB在豬糞便的基質效應考察結果

2.4 線性范圍

依據基質效應的考察結果，本方法采用了系列濃度的DFB標準溶液，制備標準曲線。

結果表明，以1/x為權重，進行加權線性回歸，在2～500 ng/mL的濃度范圍內，相應的加標樣品的濃度范圍為20～5 000 ng/g，呈良好的線性關系，代表性的標準曲線方程為：y=1.368 9x+7.156 5×10-4，R2=0.999 4，標準曲線見圖6。

圖6 DFB標準曲線

2.5 準確度和精密度

如前所述，當豬糞便中DFB的濃度分別為10 ng/g和20 ng/g時，定量離子的SNR分別滿足定性和定量檢測的要求。因此，空白豬糞便樣品中DFB的添加濃度分別為10、20、100、1 000和5 000 ng/g，以考察方法的準確度和精密度。

如表4所示，本方法的批內和批間平均準確度在93%～110%之間，批內和批間精密度均小于10%，滿足定量檢測的要求。

表4 DFB在豬糞便中的準確度與精密度

2.6 穩定性

加標樣品的凍融穩定性及處理后的穩定性試驗結果見表5。結果顯示，加標樣品經過多次凍融后，含量會發生較明顯的下降，提示在實際檢測過程中應避免樣品反復凍融；而處理后的樣品，在室溫條件下存放24 h后，其含量變化不顯著。

3 討論

除蟲脲的作用機理同三嗪類殺蠅蛆藥環丙氨嗪相似[22]，在動物的胃腸道內性質穩定，吸收較少，主要以原形同糞便排出體外[13-15]；孳生于糞便中的蠅蛆攝入藥物后，其幾丁質合成受到抑制，致其不能完成蛻皮而發育受阻，終形成畸形蛹而不能羽化為成蟲，或直接導致幼蟲死亡。

生物樣本中DFB的殘留量檢測方法主要有液相色譜-紫外檢測法[17，23]、LC-MS/MS[24-26]。LC-MS/MS具有檢測靈敏度高、化學干擾較少等優點，其使用范圍日趨廣泛；食品安全國家標準GB 23200.45—2016即采用LC-MS/MS法檢測谷物、水果、蔬菜及動物性食品中的DFB殘留量[26]。

在包括動物性食品在內的食品農/獸藥殘留檢測過程中，QuEChERS技術在樣品的提取與凈化中應用越來越廣泛[18-19]；同樣，不同基質的樣品中，DFB殘留檢測也多采用QuEChERS技術進行前處理[24，26]。因此，本研究在參考GB 23200.45—2016的基礎上，采用QuEChERS技術對豬糞便樣品進行前處理。

內標法是一個相對定量校正法，前處理、分離、檢測條件對定量結果影響不如外標法敏感；內標法可避免定量進樣帶來的不確定因素，故可獲得高定量準確度和精密度。在LC-MS/MS的分析過程中，采用穩定同位素內標，可有效降低前處理過程中以及LC-MS/MS在噴霧、離子化效率等方面的差異與不確定性，提高檢測結果的準確度和精密度，同時可在一定程度上簡化前處理過程，在定量檢測中具有無可比擬的優勢[27]。

綜上，本研究聯合采用了QuEChERS技術及同位素內標法，簡化了樣品前處理過程，省去了樣品重復提取、常規的固相萃取凈化、濃縮等過程，減少了有機溶劑的使用量，降低了可能存在的基質效應，提高了方法的準確度和精密度。結果顯示，基質背景對DFB的檢測干擾較小，方法的選擇性、靈敏度、基質效應以及準確度、精密度等均符合定量檢測的方法學要求[20]，適用于豬糞便中DFB濃度的檢測，可用于除蟲脲預混劑混飼給藥后糞便中活性成分DFB的定量檢測。