基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討真武湯合葶藶大棗瀉肺湯治療急性心力衰竭的作用機(jī)制*

張和針，劉培中，賴(lài)天偉，劉 思，艾長(zhǎng)江

廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院，廣東 珠海 519000

急性心力衰竭是各種心臟疾病進(jìn)展出現(xiàn)嚴(yán)重臨床癥狀或晚期階段，死亡率和再住院率顯著升高。發(fā)達(dá)國(guó)家的心衰發(fā)病率為1.5%～2.0%，70 歲以上人群發(fā)病率≥10%［1］。2003年流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)35～74 歲成年人中心力衰竭發(fā)病率為0.9%［2］。目前，急性心力衰竭及基于慢性心力衰竭的急性發(fā)作是全世界主要的公共疾病問(wèn)題之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，目前不斷升高的醫(yī)療水平使患心臟疾病患者生存期延長(zhǎng)，一定程度上致使我國(guó)心衰發(fā)病率呈持續(xù)升高趨勢(shì)［3］。與治療慢性心力衰竭相比，治療急性心力衰竭的藥物研究近幾十年來(lái)無(wú)較大進(jìn)展，而改善癥狀、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，可以爭(zhēng)取更多治療時(shí)間，讓醫(yī)生能更充分予患者綜合性治療，有利于改善患者生活質(zhì)量及遠(yuǎn)期預(yù)后。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》論述心力衰竭的病因病機(jī)比較復(fù)雜，時(shí)令異常可致病，臟腑經(jīng)脈傳變、飲食不節(jié)、七情內(nèi)傷、氣血失調(diào)亦可致病。《傷寒雜病論》認(rèn)為，心衰與少陰相關(guān)（指足少陰腎與手少陰心），與氣化不利、心腎陽(yáng)虛、水液不化、凌心射肺以及氣虛血瘀、血不利則為水等有關(guān)。現(xiàn)代各名醫(yī)大家對(duì)于心衰病因病機(jī)的認(rèn)知已基本形成共識(shí)［4］，大多認(rèn)為心衰病位在心，五臟相關(guān)，為本虛標(biāo)實(shí)之證，以氣虛、陽(yáng)虛、陰虛為本虛，水停、血瘀、痰飲為標(biāo)實(shí)。

真武湯與葶藶大棗瀉肺湯兩方都來(lái)源于《傷寒雜病論》，其曰：“太陽(yáng)病……其人仍發(fā)熱，振振欲……真武湯主之”“肺癰胸滿(mǎn)脹……喘鳴迫塞，葶藶大棗瀉肺湯主之”［5］。此二方均有利水功效，葶藶大棗瀉肺湯主要瀉心肺、逐水飲，而真武湯為溫陽(yáng)化氣利水劑。真武湯合葶藶大棗瀉肺湯溫陽(yáng)化氣而治本，利水逐飲以治標(biāo)，標(biāo)本兼治，諸藥合用起溫壯心腎之陽(yáng)氣、利水消腫，共奏溫陽(yáng)化氣利水之功效。藥理學(xué)研究表明，真武湯方中附子、白術(shù)、茯苓均有利尿作用［6］，其中附子是通過(guò)強(qiáng)心、擴(kuò)血管而利尿；白術(shù)是直接作用于電解質(zhì)的排泄而起利尿作用；茯苓可通過(guò)降低抗利尿激素分泌且提高滲透壓的調(diào)定點(diǎn)而利尿。另外研究表明，真武湯可增強(qiáng)心肌收縮力、減輕前后負(fù)荷、改善心臟舒縮功能［7］。葶藶大棗瀉肺湯具有強(qiáng)心、減慢心率、增強(qiáng)心肌收縮力、提高衰竭心臟的心輸出量、降低靜脈壓、松弛血管平滑肌、減少肺血管阻力、縮小擴(kuò)大的心臟等作用［8］。因此，兩方并用不僅可改善心衰患者的臨床癥狀、體征，還可擴(kuò)張血管、改善心肌舒縮功能，對(duì)改善心臟功能具有重要價(jià)值。

真武湯合葶藶大棗瀉肺湯成分復(fù)雜，靶點(diǎn)眾多，其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過(guò)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，建立真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-急性心力衰竭-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，詮釋急性心力衰竭治療急性心力衰竭的可能作用機(jī)制，以期為治療急性心力衰竭提供新的治療方法。

1 資料與方法

1.1 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯成分與潛在靶點(diǎn)篩選本研究采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索附子、生姜、茯苓、白術(shù)、白芍、葶藶子、大棗7 味中藥的全部化學(xué)成分，TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)以化合物口服生物利用度（oral bioactivity，OB）≥30%和類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為活性化合物的篩選條件。同時(shí)利用中醫(yī)分子機(jī)理生物學(xué)信息分析工具（BATMANTCM，http：//bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm/）對(duì)這7 味藥進(jìn)行檢索，檢索條件為score cutoff≥20，P-value cutoff＜0.05；檢索的化合物成分須符合OB≥30%和類(lèi)DL≥0.18，得到對(duì)應(yīng)的化合物靶點(diǎn)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)去重合并，建立真武湯合葶藶大棗瀉肺湯化學(xué)成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 急性心力衰竭疾病靶點(diǎn)的確定通過(guò)藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//db.idrblab.net/ttd/），比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（The Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（http：//ctdbase.org/），在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM0）（https：//www.omim.org/）及GenCards（http：//www.genecards.org/）檢索與急性心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)。將4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)去重合并，建立急性心力衰竭疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 獲取真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病的共同靶點(diǎn)利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）將真武湯合葶藶大棗瀉肺湯靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為標(biāo)化靶點(diǎn)，獲得swiss-prot ID，將藥物與疾病靶點(diǎn)輸入Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，獲得共同靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-急性心力衰竭疾病共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫(kù)中，以置信度分?jǐn)?shù)score＞0.9 為條件進(jìn)行篩選，并隱藏網(wǎng)絡(luò)中無(wú)聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，余參數(shù)不變，獲取真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-急性心力衰竭疾病PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能與KEGG信號(hào)通路富集分析利用David 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對(duì)真武湯合葶藶大棗瀉肺湯和急性心力衰竭疾病共同作用靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析主要用于描述基因靶點(diǎn)的功能，包括細(xì)胞功能、分子功能和生物功能。KEGG 富集分析可以得到真武湯合葶藶大棗瀉肺湯和急性心力衰竭疾病共同靶點(diǎn)所富集的信號(hào)通路。利用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“藥物-活性化學(xué)物質(zhì)-疾病-作用靶點(diǎn)-作用途徑”網(wǎng)絡(luò)圖，藥物活性成分、作用靶點(diǎn)、疾病以“節(jié)點(diǎn)”表示，節(jié)點(diǎn)之間的相互作用以“邊”表示。

2 結(jié)果

2.1 藥物-疾病靶點(diǎn)的獲取結(jié)果在TCMSP 及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)真武湯合葶藶大棗瀉肺湯治療疾病的活性成分作用靶點(diǎn)，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18，共獲得631個(gè)，去除重復(fù)靶標(biāo)后，共獲得196個(gè)潛在靶標(biāo)。見(jiàn)表1。

表1 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯中OB值前10的化合物基本信息

2.2 急性心力衰竭疾病靶點(diǎn)篩選通過(guò)在TTD，CTD，OMIM 和GenCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，限定Score≥10，共得到與AS 疾病相關(guān)人類(lèi)靶點(diǎn)2271個(gè)。

2.3 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病共同作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)利用Venny 2.1 繪制韋恩圖，篩選出真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病的共同的靶點(diǎn)，得到共同靶點(diǎn)127 個(gè)，有HTR3A、MMP2、ACHE、AKR1B1、ADRA2B、ADRA2C、AR、SLPI、BAX、BCL2等。見(jiàn)圖1。

圖1 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病靶點(diǎn)的匹配韋恩圖

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI構(gòu)建將127個(gè)真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病共同靶點(diǎn)的潛在靶點(diǎn)錄入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行分析得到PPI，見(jiàn)圖2A。該網(wǎng)絡(luò)圖共包含127 個(gè)節(jié)點(diǎn)，394 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為6.4，平均局部聚類(lèi)系數(shù)為0.45，其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大。導(dǎo)入Cytoscape 軟件，利用Cytoscape 中cytoHubba插件，挖掘hub 基因，ESR1、AKT1、JUN、MYC、MAPK1、MAPK14、CXCL8、FOS、IL-1B、IL-6 為排名前十的基因，這些靶基因可能是PPI 網(wǎng)絡(luò)中的樞紐節(jié)點(diǎn)，也很可能是白芍總苷治療OLP 的核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2B。

圖2 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析蛋白的相互作用

2.5 共同作用靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG通路分析GO 富集分析：P值代表富集的顯著性，相應(yīng)的P值越小，其顏色越偏向紅色，反之顏色偏向藍(lán)色；橫坐標(biāo)表示富集數(shù)目。提示真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-急性心力衰竭疾病-基因的生物過(guò)程（BP）顯著富集在脂多糖、細(xì)菌源、金屬離子、營(yíng)養(yǎng)水平、氧自由基、抗生素反應(yīng)等；分子功能（MF）主要富集在血紅素結(jié)合、兒茶酚胺結(jié)合、四吡咯結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。細(xì)胞組分（CC）主要富集在膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)域、小凹、質(zhì)膜筏、囊腔等。見(jiàn)圖3A—C。

圖3 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯與急性心力衰竭疾病靶點(diǎn)的生物功能分析

KEGG 富集分析：將得的127 個(gè)共作靶點(diǎn)通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，運(yùn)行后得到147條通路。將通路排名前20位的結(jié)果繪制得到條形圖，見(jiàn)圖4。橫坐標(biāo)表示靶點(diǎn)數(shù)，縱坐標(biāo)表示通路名稱(chēng)，顏色表示P值，P值越小顏色越偏向紅色，P值越大則越偏向藍(lán)色。結(jié)果顯示，真武湯合葶藶大棗瀉肺湯治療急性心力衰竭疾病靶點(diǎn)主要富集的是AGE-RAGE 糖尿病并發(fā)癥中的信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、TLR 信號(hào)通路（toll-like receptor signaling pathway）等，提示真武湯合葶藶大棗瀉肺湯治療急性心力衰竭疾病可能通過(guò)以上多條信號(hào)通路起到協(xié)同作用。

圖4 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯治療急性心力衰竭的KEGG富集分析

2.6 真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-成分-作用靶點(diǎn)-通路-急性心力衰竭疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用Cytoscape軟件構(gòu)建真武湯合葶藶大棗瀉肺湯-成分-作用靶點(diǎn)-通路-急性心力衰竭疾病的網(wǎng)絡(luò)模型。其中黃色菱形節(jié)點(diǎn)代表疾病、紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表藥物、粉紅色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表成分，藍(lán)色長(zhǎng)方形節(jié)點(diǎn)代表共同作用靶點(diǎn)，黃色三角形代表KEGG，綠色橢圓形代表通路，邊代表相互作用關(guān)系。其中檞皮素、β-谷固醇、山柰酚、芍藥苷、β-胡蘿卜素、光千金藤堿能與60 個(gè)以上靶點(diǎn)相連接，推測(cè)這6 個(gè)成分是真武湯合葶藶大棗瀉肺湯中多靶點(diǎn)治療急性心力衰竭疾病的主要活性成分。ESR1、AKT1、JUN、MYC、MAPK1、MAPK14、CXCL8、FOS、IL-1B、IL-6 這些靶點(diǎn)可能在急性心力衰竭疾病治療中發(fā)揮重要的作用。以上結(jié)果可以得出真武湯合葶藶大棗瀉肺湯的各個(gè)成分通過(guò)多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路來(lái)治療急性心力衰竭疾病。見(jiàn)圖5。

圖5 中藥-成分-潛在性靶標(biāo)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

急性心力衰竭發(fā)作時(shí)，以穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)、糾正低氧，維護(hù)各臟器灌注和功能、治療急性心力衰竭的病因和誘因、預(yù)防血栓栓塞等為治療目標(biāo)。前期臨床研究提示，真武湯合葶藶大棗瀉肺湯可在西醫(yī)基礎(chǔ)治療上進(jìn)一步提高陽(yáng)虛水泛型急性心力衰竭患者的治療作用。目前真武湯合葶藶大棗瀉肺湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制不十分明確。

本研究結(jié)果顯示，通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出真武湯合葶藶大棗瀉肺湯活性成分主要有檞皮素、β-谷固醇、山柰酚、芍藥苷、β-胡蘿卜素、光千金藤堿等。山柰酚（kaempferol）屬于黃酮類(lèi)化合物，主要來(lái)源于姜科植物山柰的根莖，又名山柰黃酮醇、山柰素、四羥基黃酮、山柰酚-3 等，具有抗癌、防癌、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎等多種作用［9-10］。槲皮素是一種黃酮類(lèi)化合物，具有很強(qiáng)的生物活性，可通過(guò)減少氧化應(yīng)激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和下調(diào)活性氧介導(dǎo)的下游信號(hào)通路等方式，發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗菌和保護(hù)心血管等藥理作用［11］。提示這些活性成分在治療急性心力衰竭疾病中發(fā)揮著顯著效果。這與目前基礎(chǔ)研究的結(jié)果相同，證實(shí)了本研究預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。

通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建靶點(diǎn)交互作用網(wǎng)絡(luò)，分析得到排名前10 位的靶點(diǎn)有ESR1、AKT1、JUN、MYC、MAPK1、MAPK14、CXCL8、FOS、IL-1B、IL-6，提示這些靶點(diǎn)可能是治療急性心力衰竭中的重要靶點(diǎn)。E2通過(guò)膜ESR 而與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白發(fā)生作用，它發(fā)揮心血管保護(hù)作用是由ESR1 非轉(zhuǎn)錄途徑介導(dǎo)的，可以活化內(nèi)皮細(xì)胞中的一氧化氮合酶［12］。AKT1 作用通道調(diào)控細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過(guò)程。JUN 是重要的絲裂原活化蛋白激酶，是把細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡等多種生理反應(yīng)過(guò)程［13］。缺氧可導(dǎo)致動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)的基因的表達(dá)水平發(fā)生變化，通過(guò)下調(diào)缺氧條件下細(xì)胞中FOS 基因的表達(dá)，可以抑制NR4A1基因，并降低由于缺氧升高的p38的磷酸化，從而起到減輕動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用［14］。綜上所述，真武湯合葶藶大棗瀉肺湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)上述基因靶點(diǎn)的表達(dá)，減輕由其引發(fā)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝、炎癥反應(yīng)，從而延緩急性心力衰竭進(jìn)展。

GO 功能富集分析顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物過(guò)程顯著富集在脂多糖、細(xì)菌源、金屬離子、營(yíng)養(yǎng)水平、氧自由基、抗生素反應(yīng)等；分子功能主要富集在血紅素結(jié)合、兒茶酚胺結(jié)合、四吡咯結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。細(xì)胞組分主要富集在膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域。這些生物學(xué)功能在上述活性成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的通路都有所體現(xiàn)。

KEGG 通路富集結(jié)果提示，真武湯合葶藶大棗瀉肺湯可能是AGE-RAGE 糖尿病并發(fā)癥中的信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TLR 信號(hào)通路，起到治療急性心力衰竭的作用。AGEs-RAGE 信號(hào)通路激活NF-κB，可引起大量黏附分子、生長(zhǎng)因子、促炎細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素8、腫瘤壞死因子α）等的表達(dá)和釋放，最終引起慢性細(xì)胞活化和組織損傷［15］。糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE途徑與心腎綜合征發(fā)病密切相關(guān)［16］。晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）與不同組織RAGE 受體結(jié)合會(huì)誘發(fā)炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮功能障礙等，是心腎綜合征主要發(fā)病機(jī)制之一［17］。AGEs 水平增高是急性心力衰竭患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［18］。IL-17 信號(hào)通路一是具有聚集和激活中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的功能；二是通過(guò)核因子κB 途徑促進(jìn)多種炎癥遞質(zhì)的釋放，從而放大炎癥反應(yīng)，加重組織損傷［19］。TNF 信號(hào)通路不僅與炎癥、凋亡密切相關(guān)，而且其與PI3K-Akt 信號(hào)通路間的交叉作用參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)［20］。可見(jiàn)真武湯合葶藶大棗湯中的活性成分對(duì)急性心力衰竭的生物過(guò)程及多條信號(hào)通路具有調(diào)控作用。

多項(xiàng)研究提示，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究可以闡明中藥“多成分-多靶標(biāo)”的作用特點(diǎn)。本研究經(jīng)過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，真武湯合葶藶大棗瀉肺湯通過(guò)主要活性化合物檞皮素、β-谷固醇、山柰酚、芍藥苷等的靶標(biāo)調(diào)節(jié)機(jī)制和AGE-RAGE、IL-17等信號(hào)通路，發(fā)揮治療急性心力衰竭的作用，這為更深入探討其作用機(jī)制提供了新方向，但仍需更多的實(shí)驗(yàn)及臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。