董氏奇穴聯合丁沉扶正湯改善胃癌術后患者腸道菌群紊亂的作用機制研究*

張 靜，高曉杰，富穎超，韓 玫，鄧力威，陳 娟

1 河北省退役軍人總醫院，河北 邢臺 054000； 2 邢臺市中醫院，河北 邢臺 054001

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，統計結果表明2018 年內結腸原發性腫瘤患者中胃癌的死亡率為8.2%，排名所有腫瘤的第二［1］。手術是胃癌的主要治療方法之一，但是由于腫瘤患者本身存在免疫抑制，并且麻醉、手術也會影響患者的免疫情況，這會嚴重影響術后恢復［2］。研究表明，胃癌術后患者腸內微生物會異常繁殖，甚至侵入腸外組織，不但影響患者胃腸功能，甚至會導致全身性炎癥反應，影響患者預后［3］。環芳香烴受體（cyclic aromatic hydrocarbon receptor，AhR）的表達受到腸道細菌的激活，可促進白細胞介素22（interleukin-22，IL-22）/信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的信號轉導，促進腸黏膜組織的修復，阻止細菌入侵，調節機體的免疫炎癥反應［4］。近年來，針藥聯合的方法在調節免疫和輔助治療癌癥中取得了重大進展。董氏奇穴針灸手法，來自《董氏奇穴針灸學》，其理論基于“穴位空間論”和“奇正接軌論”。研究顯示，以董氏奇穴為基礎的針藥聯合不但具有調節免疫的作用［5］，還可以有效提高胃腸道功能［6］。研究顯示，扶正湯可以提高晚期胃癌患者的免疫能力，并具有緩解化療副作用的功能［7］。但是兩者聯合是否可以改善胃癌術后患者的免疫水平尚不清楚。因此，本文主要基于AhR/IL-22/STAT3 途徑探討董氏奇穴聯合丁沉扶正湯對胃癌患者術后免疫水平及腸道菌群的影響，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2017 年6 月至2019 年6 月在河北省退役軍人總醫院進行胃癌手術的患者120 例，將以上患者隨機分為對照組和針藥聯合組，每組60 例。對照組中男35 例，女25 例；平均年齡（53.92±4.94）歲；TNM 分期：Ⅰ期14 例，Ⅱ期31 例，Ⅲ期15 例。針藥聯合組中男37 例，女23例；平均年齡（55.52±5.10 歲；TNM 分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期33例，Ⅲ期15例。兩組患者性別、年齡等基線資料比較，差異無統計學意義（P＜0.05），具有可比性。

1.2 納入標準納入：1）符合腹腔鏡下胃癌根治術手術標準者［8］；2）病理學活檢確診為胃癌者；3）年齡40～70 歲者；4）本研究符合赫爾辛基宣言，所有患者均知情同意，并經醫院倫理委員會批準（倫理批件號：第2017-053號）。

1.3 排除標準排除：1）接受化療、放療者；2）合并其他惡性腫瘤者；3）合并高血壓、糖尿病及血液學疾病和其他消化道疾病者。

1.4 治療方法兩組患者均行腹腔鏡下胃癌根治術。1）對照組給予針刺治療：根據董氏奇穴原理，取土水穴，四花上、中、下三穴，天皇、人皇、地皇三穴，門金上、下二穴，靈骨、大白穴，以此為基礎組穴，隨證加減。直刺0.5～1 寸，輕提捻轉至患者出現麻脹感，留針30 min，每日1次。2）針藥聯合組在對照組的基礎上給予丁沉扶正湯治療，藥物組成：太子參30 g，沉香30 g，烏藥30 g，丁香30 g，檳榔30 g，陳皮15 g，半夏15 g，茯苓15 g，蘇葉10 g，生姜10 g，大棗10 g，炙甘草10 g。水煎分兩次服用。兩組均連續治療7天。

1.5 觀察指標

1.5.1 術中指標 比較兩組術中基本指標：手術時間、術中出血量及清掃淋巴結數目。

1.5.2 腸道菌群 分別收集術后患者首次排便和干預后糞便樣本0.5 g，立即使用無菌水稀釋，利用半自動微生物鑒定儀（ATB，梅里埃公司，法國）分析細菌含量，單位為l g/g。

1.5.3 T淋巴細胞亞群水平 在術后第2天和干預后收集患者外周血15 mL，其中10 mL 通過流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群水平。通過FACSCalibur流式細胞儀（美國Becton Dickinson 公司）測定CD3+、CD4+、CD8+細胞的百分比。

1.5.4 血清指標 將“1.5.3”項下收集的血液樣本靜置后離心，應用ELISA（Abcam 公司，美國）試劑盒檢測血清中D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）、降鈣素原、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平，根據試劑盒說明書分別加入抗體和顯色劑，然后在450 nm 處檢測吸光度值。根據標準曲線計算濃度。

1.5.5 RT-qPCR 檢測AhR、IL-22 和STAT3 mRNA表達水平 分別在手術時和術后7 天通過腸鏡收集結腸黏膜組織，通過TRIzol（Sigma 公司，USA）從組織中提取總RNA，并檢測其純度。對收集的RNA 進行反轉錄，試劑盒為PrimeScript-RT 試劑盒（Takara 公司，日本），條件為42 ℃/60 min，70 ℃/5 min，4 ℃下保存，然后利用SYBR Premix Ex Taq?試劑盒（Takara 公司，日本）進行qPCR實驗，95 ℃/10 min，94 ℃/15 s，60 ℃/1 min，4 ℃下保存。使用GAPDH 作為內參，通過2-ΔΔCq分析AhR、IL-22 和STAT3 mRNA 表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.6 Western blot 檢測AhR、IL-22 和STAT3蛋白表達水平 將“1.5.5”項中的結腸黏膜組織樣本研磨萃取總蛋白，通過BCA試劑盒測量濃度。分別取總量為40 μg 的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳（80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜（Bio-Rad公司，美國）進行濕轉移。在5%牛血清白蛋白中于室溫孵育1 h。將1∶500 稀釋的anti-AhR、anti-IL-22 和anti-STAT3（Abcam 公司，美國）添加到分離的蛋白質中，并在4 ℃下孵育過夜。洗滌后在室溫下添加HRP 標志的二抗孵育1 h。然后加入化學發光試劑進行顯影。GAPDH 用作內參，用Image J 軟件分析目標條帶的灰度值。

1.5.7 患者恢復情況 統計每位患者的住院時間及并發癥發生情況。

1.6 統計學方法本研究的數據分析采用SPSS 19.0 進行，計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 手術指標兩組手術時間、出血量及清掃淋巴結數目比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組手術指標比較（±s）

表2 兩組手術指標比較（±s）

組別對照組針藥聯合組例數60 60 t P手術時間（min）95.25±18.57 97.71±19.34 0.724 0.419出血量（mL）89.75±14.38 87.16±15.42 0.683 0.497清掃淋巴結數目（枚）19.76±2.13 19.15±2.26 0.248 0.841

2.2 腸道菌群兩組干預前腸道各種菌群含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；干預后兩組乳酸桿菌和雙歧桿菌含量均升高（P＜0.05），且針藥聯合組高于對照組（P＜0.05）；干預后兩組大腸桿菌、梭菌、擬桿菌和柔嫩梭菌水平均降低（P＜0.05），且針藥聯合組低于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組干預前后腸道菌群水平比較

2.3 T 淋巴細胞亞群水平兩組干預前外周血T細胞亞群水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；干預后兩組CD3+和CD4+細胞比例及CD4+/CD8+比值均較干預前升高（P＜0.05），且針藥聯合組高于對照組（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組干預前后T細胞亞群水平比較

2.4 外周血D-LA 和炎性因子水平兩組干預前血清D-LA 和炎性因子水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；干預后兩組各項指標均較干預前降低（P＜0.05），且針藥聯合組各項指標均低于對照組（P＜0.05）。見表5。

表5 兩組干預前后外周血D-LA和炎性因子水平比較

2.5 AhR、IL-22 和STAT3 mRNA 及 蛋 白 表 達水平兩組干預前結腸黏膜組織中AhR、IL-22 和STAT3 mRNA 及蛋白表達水平比較，差異有統計學（P＜0.05）；干預后兩組各項指標均較干預前升高，其中針藥聯合組各項指標高于對照組（P＜0.05）。見表6、圖1。

圖1 兩組腸黏膜AhR/IL-22/STAT3中蛋白表達水平

表6 兩組術后及干預后AhR、IL-22和STAT3 mRNA及蛋白表達水平比較（±s）

表6 兩組術后及干預后AhR、IL-22和STAT3 mRNA及蛋白表達水平比較（±s）

注：a表示與本組術后比較，P＜0.05

組別對照組針藥聯合組例數60 60干預后4.21±0.40 a 5.68±0.53 a 18.647 0.000干預后4.08±0.38 a 5.54±0.51 a 19.524 0.000 P組別對照組針藥聯合組IL-22 mRNA術后2.69±0.24 2.55±0.23 0.753 0.438 IL-22 蛋白術后1.41±0.13 1.29±0.12 0.834 0.312 t例數60 60干預后4.34±0.41 a 6.04±0.56 a 21.953 0.000干預后2.46±0.22 a 3.38±0.31 a 14.723 0.000 AhR mRNA術后2.75±0.24 2.63±0.25 0.612 0.463 AhR蛋白術后1.32±0.12 1.41±0.15 0.686 0.475 t P干預后2.06±0.19 a 3.19±0.30a 14.864 0.000干預后2.27±0.23 a 3.08±0.30 a 11.806 0.000 STAT3 mRNA術后2.78±0.26 2.92±0.27 0.343 0.662 STAT3蛋白術后1.56±0.15 1.50±0.14 0.275 0.714

2.6 并發癥發生情況及住院時間針藥聯合組術后發生切口感染1 例，腹腔感染1 例，并發癥發病率3.33%（2/60）；對照組術后發生切口感染3例，腹腔感染3 例，肺部感染2 例，并發癥發病率13.33%（8/60）。兩組比較，差異有統計學意義（χ2=3.927，P=0.048）。住院時間針藥聯合組為（11.28±2.17）天，對照組為（16.75±2.48）天，針 藥聯合組短于對照組（t=50812，P=0.000）。

3 討論

腹腔鏡下行胃癌根治術是治療非轉移性胃癌的重要方法，但是研究顯示麻醉過程、手術過程均會引起患者的應激反應，這會提高炎性水平抑制免疫能力。研究證實，接受胃癌根治術的患者在術后會出現腸道功能紊亂和免疫水平降低，這會引起細菌過度繁殖和腸道黏膜損傷，進而使腸道內的微生物和內毒素通過腸黏膜侵入腸外組織，影響術后康復［9］。

大量臨床證據表明，中醫中藥可以輔助治療癌癥和提高機體免疫能力。本研究結果顯示，針藥聯合可以明顯促進術后腸道有益菌（乳酸菌和雙歧桿菌）的恢復，減少大腸桿菌等有害菌的繁殖，提高外周血中CD3+、CD4+及CD4+/CD8+的水平。臨床證實針刺治療可以促進胃癌術后胃腸蠕動、促進腸道積氣排出，加快恢復消化道的正常功能［10］。本研究研究了相關的科研、文獻材料及書籍，從中國傳統醫學角度出發，根據中醫理論，術后耗氣傷血、正氣虧虛，氣虛則運行無力，滯于胃腸，導致胃癌術后消化道功能紊亂。據此，本研究組建中藥組方丁沉扶正湯，配合董氏奇穴益氣健脾，和胃降逆，從根本上縮短胃癌術后消化道功能紊亂的病程［11］。丁沉扶正湯不但可以抑制腫瘤組織中原癌基因的表達，還可以促進巨噬細胞功能提高免疫能力［12］。陸潔等［13］研究顯示，扶正湯可以緩解晚期胃癌患者的免疫抑制情況并延長患者生存期。針藥聯合可以協同作用，激發中藥藥性，進一步提高治療效果。研究表明，在扶正湯的基礎上聯合針灸可以促進中藥的治療效果［14］。

董氏奇穴是一種傳統的針刺手法，其針藥聯合可以進一步調控免疫［15］。本研究結果顯示，董氏奇穴聯合丁沉扶正湯可以共同提高消化道功能，調節腸道菌群，進而阻止D-LA 等入侵，緩解炎性反應并調節免疫反應，抑制腸道有害菌的過度繁殖，進而促進胃癌患者術后恢復。

腸黏膜是阻止大腸桿菌及其分泌的D-乳酸等入侵的關鍵屏障。研究顯示，麻醉和胃癌手術均會引起腸黏膜受損，從而影響胃癌患者的預后［16-17］。AhR表達于腸黏膜上皮組織，腸道菌群的失調會影響AhR 的表達，進而抑制IL-22 的水平。IL-22會激活STAT3并促進其核轉位，進而促進細胞增殖相關基因的轉錄水平，使腸黏膜細胞增殖促進腸黏膜組織的修復［18］。而腸黏膜組織的修復會使機體的免疫水平恢復，進而反過來調控腸道菌群［19］。本研究結果顯示，在術后的恢復過程中，AhR/IL-22/STAT3 轉錄和翻譯的水平升高，而針藥聯合可以進一步促進腸黏膜組織表達AhR、IL-22和STAT3 mRNA 和蛋白，進而促進腸黏膜屏障恢復。研究顯示，黃芪中的活性單體黃芪甲苷Ⅳ可通過抑制NLRP3 炎癥小體信號傳導緩解敗血癥誘導的腸屏障功能障礙［20］。體內研究顯示，黨參可以促進腸黏膜功能的恢復［21-22］。本研究結果顯示，董氏奇穴聯合丁沉扶正湯可通過促進AhR/IL-22/STAT3 通路轉錄和翻譯的水平促進腸黏膜的修復，進而阻止D-LA 等入侵，緩解炎性反應并調節免疫反應，抑制腸道有害菌的過度繁殖，進而促進胃癌患者術后恢復。

綜上所述，董氏奇穴聯合丁沉扶正湯可能通過促進AhR/IL-22/STAT3 通路保護腸黏膜屏障，進而促進胃癌患者術后的細胞免疫緩解腸道菌群失衡，促進患者恢復。但是關于奇穴聯合丁沉扶正湯提高胃癌患者術后恢復以及調控AhR/IL-22/STAT3通路的分子機制仍需要進一步研究。