HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定芪防敗毒合劑中綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

鄭乾文，楊 輝，林 靜，尤文質(zhì)，蘇娟娟，許光輝，羅友華，陳雪梅*

（1.廈門市中醫(yī)院，福建 廈門 361009；2.廈門市醫(yī)藥研究所，福建 廈門 361008；3.廈門市天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361008）

芪防敗毒合劑系廈門市中醫(yī)院制劑室配制的院內(nèi)制劑，由黃芪、麩炒白術(shù)、防風(fēng)、金銀花等9 味飲片組成，具有益氣固表、透邪敗毒的功效。該方由玉屏風(fēng)散加減，經(jīng)廈門市中醫(yī)院中醫(yī)藥防治呼吸道傳染病專家組共同研討制定，用于治療表虛不固、外感邪毒、發(fā)熱身倦、自汗惡風(fēng)、面色?白或體虛易感易病者［1］。該制劑已獲福建省藥品監(jiān)督管理局備案（制劑備案號(hào)：閩藥制備字Z20230001000）。

根據(jù)芪防敗毒合劑的組方依據(jù)，本文選擇方中君藥黃芪和佐藥金銀花的有效指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，以提高該制劑的質(zhì)控水平。《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定了黃芪中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（calycosin 7-O-β-D-glucopyranoside，CG）和金銀花中綠原酸（chlorogenic acid，CA）的含量限度［2］。由于黃芪甲苷無紫外吸收，需使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，使用較不方便，因此，本文未建立芪防敗毒合劑中黃芪甲苷的含測(cè)方法。本文采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD），建立了HPLC 多波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定芪防敗毒合劑中CG 和CA 的含量，為該制劑工藝優(yōu)選和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 XS205 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，d=0.01 mg）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）。

1.2 試藥 甲醇、乙腈均購自美國(guó)Tedia 公司（色譜純，批號(hào)：21070347、21010427）；磷酸（分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司，批號(hào)：20210530）；自制超純水；CA 對(duì)照品（純度為96.3%）、CG 對(duì)照品（純度為96.8%）均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：110753-202119、111920-201907）。

黃芪、麩炒白術(shù)、防風(fēng)、金銀花等9 味飲片購自國(guó)藥控股廈門有限公司，經(jīng)廈門市中醫(yī)院尤文質(zhì)副主任藥師鑒定，所用飲片均符合2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》要求。芪防敗毒合劑（批號(hào)：20221201、20221202、20221203）由廈門市中醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～11 min，11%A；11～12 min，11%～22%A；12～17 min，22%～25%A；17～18 min，25%～100%A；18～21 min，100%A；21～21.1 min，100%～11%A；21.1～25 min，11%A）；流速1 mL/min；CA、CG 檢測(cè)波長(zhǎng)分別為326、260 nm；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃。CA 峰的理論塔板數(shù)≥8 000，CG 峰的理論塔板數(shù)≥10 000。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取CA 對(duì)照品和CG 對(duì)照品適量，用50%甲醇定容制成467.14、28.09 μg/mL 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取該混合對(duì)照品儲(chǔ)備液100、249、498、747、997、1 246、1 495、1 744、1 993 μL，置于5 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，得到CA 質(zhì)量濃度分別為9.34、23.26、46.53、69.79、93.15、116.41、139.67、162.94、186.20 μg/mL，CG 質(zhì)量濃度分別為0.56、1.4、2.8、4.2、5.6、7、8.4、9.8、11.2 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取芪防敗毒合劑1.5 g，置10 mL 量瓶中，加50%甲醇混勻定容，靜置30 min后，用0.45 μm 尼龍膜過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.3 陰性供試品溶液 分別稱取不含金銀花和不含黃芪的芪防敗毒合劑陰性處方1.5 劑，按芪防敗毒合劑制備工藝，分別制得缺金銀花和缺黃芪的陰性芪防敗毒合劑。分別精密稱取陰性芪防敗毒合劑各1.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備缺金銀花陰性供試品溶液、缺黃芪陰性供試品溶液。

2.3 HPLC 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別測(cè)定混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺黃芪陰性供試品溶液、缺金銀花陰性供試品溶液和50%甲醇溶劑空白溶液，記錄色譜圖。供試品溶液中CG和CA 分離度和理論板數(shù)均符合要求，陰性無干擾，說明建立的HPLC 方法系統(tǒng)適用性良好。見圖1、圖2。

圖1 芪防敗毒合劑中CA 的高效液相色譜圖

圖2 芪防敗毒合劑中CG 的高效液相色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以各成分對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各成分回歸方程。結(jié)果顯示：CA 的線性方程為Y=16.095X-4.771 1，r=0.999 7，線性范圍為9.34～186.20 μg/mL；CG 的線性方程為Y=16.48X-0.427 1，r=0.999 7，線性范圍為0.56～11.20 μg/mL，說明CA 和CG 分別在上述范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取芪防敗毒合劑（批號(hào)：20221201）6 份，每份1.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示芪防敗毒合劑中CA、CG含量均值分別為0.593 0、0.039 5 mg/g，RSD 分別為3.22%、3.53%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別記錄CA、CG 峰面積并計(jì)算RSD 分別為0.26%、0.86%，表明該方法進(jìn)樣精密度良好。

2.3.5 儀器精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算CA、CG 峰面積的RSD 分別為0.21%、0.23%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 中間精密度試驗(yàn) 第2 天，與重復(fù)性試驗(yàn)不同的實(shí)驗(yàn)人員按“2.2.2”項(xiàng)下方法，平行制備芪防敗毒合劑（批號(hào)20221201）供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算CA、CG 含量的RSD 分別為1.50%、1.60%，表明中間精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取芪防敗毒合劑（批號(hào)：20221201）供試液，于制備后0、5、8、12、16 h 分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算CA、CG 峰面積的RSD 分別為1.97%、3.93%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的芪防敗毒合劑（批號(hào)：20221201，CA 含量為0.616 2 mg/g，CG 含量為0.050 0 mg/g） 9 份，分別置10 mL 量瓶中，再分別按接近1∶1 的比例加入混合對(duì)照品溶液，用50%甲醇定容后，搖勻，用0.45 μm 尼龍膜濾過，取續(xù)濾液，作為回收率供試品溶液。分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算CA 和CG 的加樣回收率和RSD。

結(jié)果顯示：CA 回收率為104.02%～111.77%，平均回收率為107.63%，RSD 為2.91%，符合2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》中回收率限度80%～115%、RSD 限度6%的要求，見表1。CG 的回收率為98.43%～107.32%，平均回收率為103.17%，RSD為2.86%，符合2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》中回收率限度80%～115%、RSD 限度6%的要求，見表2。

表1 CA 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 CG 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 芪防敗毒合劑中CA、CG 含量測(cè)定 取3 批芪防敗毒合劑樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法，每批平行制備供試品溶液2 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算芪防敗毒合劑中CA、CG 含量。3 批芪防敗毒合劑中，CA 含量范圍為0.748 9～0.831 6 mg/g，CG 含量范圍為0.058 0～0.054 2 mg/g。見表3。

表3 芪防敗毒合劑中CA、CG 含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

3 討 論

3.1 有效指標(biāo)成分的選擇 基于傳統(tǒng)功效、化學(xué)成分有效性、可測(cè)性、植物親緣學(xué)及藥動(dòng)學(xué)等進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析，黃芪甲苷等皂苷類可作為黃芪的質(zhì)量標(biāo)志物［3］。金銀花是治療瘟疫的主要藥物，其CA 等酚酸類成分能抑制多種炎癥因子的表達(dá)，還能阻止SARS-CoV-2 侵入人體，可見，金銀花的CA 等酚酸類成分可作為治療COVID-19 的潛在活性成分［4］。因此，根據(jù)芪防敗毒合劑的組方依據(jù)和2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文選擇合劑中CG 和CA 作為芪防敗毒合劑方中君藥黃芪和佐藥金銀花質(zhì)量控制中含測(cè)有效指標(biāo)成分。芪防敗毒合劑處方中白術(shù)［5］、防風(fēng)［6］等飲片也有抗病毒活性，將采取定性鑒別法對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在DAD 檢測(cè)器上分別讀取CG 對(duì)照品和CA 對(duì)照品的190～400 nm 波長(zhǎng)范圍光譜圖，CG 的最合適波長(zhǎng)為260 nm，CA 的最大吸收波長(zhǎng)為326 nm，2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》記載黃芪中CG、金銀花中CA 的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為260、326 nm，故選擇這2 個(gè)波長(zhǎng)分別測(cè)定CG 和CA 的含量。

3.3 供試品溶液稀釋溶劑種類的優(yōu)選 分別采用水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇、50%乙腈、乙腈等溶劑制備供試品溶液，發(fā)現(xiàn)水為溶劑測(cè)得CA和CG 含量均很低；50%甲醇測(cè)得CA 含量第2 高，相對(duì)均差較小；甲醇產(chǎn)生很多粥樣沉淀，CA 含量較低；50%乙醇測(cè)得CA 含量最高，相對(duì)均差較大；乙醇產(chǎn)生團(tuán)塊沉淀，操作穩(wěn)定性較低；50%乙腈測(cè)得CG 含量第2 高，但CA 含量較低；乙腈導(dǎo)致很多浸膏未溶化，2 個(gè)成分含量均最低。所以，制備芪防敗毒合劑供試品的稀釋溶劑初步選擇50%甲醇。

3.4 甲醇濃度的優(yōu)選 分別用100%、90%、80%、70%、60%、50%甲醇制備供試品溶液，發(fā)現(xiàn)CA 含量用50%甲醇稀釋最高，80%甲醇和100%甲醇第2 高，CG 含量用100%甲醇最高，50%甲醇次之。為了節(jié)約甲醇用量，確定以50%甲醇制備芪防敗毒合劑供試品溶液最好。

本文根據(jù)文獻(xiàn)［7-9］，結(jié)合多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，建立了HPLC-DAD 法同步測(cè)定芪防敗毒合劑CG 和CA的含量，經(jīng)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)、線性及線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度等方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明本文建立的HPLC 法符合2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)要求，具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確高效、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，為芪防敗毒合劑的工藝研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定奠定基礎(chǔ)。