多組學技術在人參屬藥用植物抗根部病害研究中的應用

李雅淑，張寧，李冉琪，張晶晶，侯微，李亞麗，曲正義，鄭培和

[1.中國農業科學院特產研究所，吉林省中藥材種植（養殖）重點實驗室，吉林 長春 130112；2.吉林農業科技學院，吉林 吉林 132109]

人參（Panax ginseng）、西洋參（P.quinquefolium）和三七（P.notoginseng）是我國名貴中藥材，具有珍貴的藥用價值，其藥用部位為多年生宿根。人參生長周期長，易受多種病原菌侵染，其中根腐病和銹腐病是栽培過程中高發的根部土傳性真菌病害，具有易傳播、致死率高和防治難度大等特點，常造成大幅減產[1]。目前根部病害的防治多依賴化學手段，這不僅會引起藥材農殘超標，同時還會帶來環境破壞等其他方面的問題，因此培育優良品種是進一步發展藥用植物栽培產業的重要前提，培育新型抗病品種對于根部病害防治具有重要意義。

隨著高通量測序技術的發展，各組學技術在植物抗病育種中的應用越來越廣泛。本文綜述了多組學技術在人參、西洋參和三七在抗根部病害應用中取得的研究進展。

1 基因組學

1.1 DNA分子標記

DNA 分子標記（DNA molecular markers）技術是以脫氧核糖核酸（DNA）為基礎，在分子水平上研究生物體的遺傳信息差異，進而揭示生物體遺傳規律及表型性狀規律的技術。近年來，該技術已廣泛應用于藥用植物親緣關系鑒定、道地性研究和生物多樣性保護等領域，其在藥用植物抗病育種方面有極其廣闊的應用前景[2-4]。

1.1.1 SSR分子標記 簡單重復序列標記（Simple sequence repeats,SSR）又稱微衛星序列標記（Microsatellite sequence,MS），是以PCR 技術為基礎的分子標記技術，其串聯重復的核心序列為1～6 bp，其中最常見是雙核苷酸重復，重復單位數目10～60 個，其高度多態性主要來源于串聯數目的不同[5,6]。

KIM 等[7]通過SSR 分子標記構建了人參富含微衛星序列的基因組文庫，可用于人參物種的連鎖分析、遺傳育種和鑒定。范馨元等[8]基于EST-SSR 標記對人參、西洋參和三七進行鑒別，發現引物P2 和Q11 的組合鑒定效果最好，對于人參、西洋參和三七的市售商業產品檢出率均在85%以上。在藥用植物中，SSR 分子標記已廣泛應用于多種藥用植物種質資源遺傳多樣性分析，但在抗病育種中應用較少。張晶晶等[9]以人參抗、感根腐病株系基因組DNA 為模板，對SSR 多態性引物進行了人參根腐病抗病性分子標記的篩選，表明引物P29 可以將人參抗、感根腐病株系區分開來，該標記可能與人參根腐病抗性相關，可用于人參抗根腐病種質的早期篩選。

1.1.2 SNP 分子標記 單核苷酸多態性（Single nucl eotide polymorphism,SNP）是第三代DNA 分子標記，是等位基因間單個核苷酸的差異引起的多態性，包括轉換、顛換、插入和缺失等。SNP 描述的是雙等位基因多態性，數量遠高于SSR，在生物、醫學和農學等多領域得到了廣泛應用[10-12]。

董林林等[13]和陳中堅等[14]通過簡化基因組測序技術，發現了1 個與三七抗、感根腐病相關的SNP 位點，利用DNA 標記輔助育種，選育出三七抗病品種“苗鄉抗七1 號”。對三七抗病品種的種苗等級鑒定及發病率評價表明抗病品種種苗根腐病及銹腐病發病率均顯著下降，且抗性評價表明‘苗鄉抗七1 號’種子、種苗和塊根都對根腐病表現出明顯抗性。DNA標記輔助育種有助于縮短育種年限，加快抗病品種的選育進程。

1.2 抗病基因挖掘

植物抗病基因（Resistance gene）是在植物免疫及抗病反應過程中抵抗病原微生物侵染及減緩傳播的重要基因[15]。因此，尋找人參屬植物抗病基因，了解抗病機制，將有助于從分子角度入手改良物種性狀，對培育抗病品種具有重要意義。

病程相關蛋白（Pathogenesis-related proteins,PRs）、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）和幾丁質酶（Chitinase,CHI）等是植物抗病防御反應體系中的重要組成部分。李瑞博等[16]優化了三七病程相關蛋白PnPR1 的誘導條件，為蛋白純化及制備單克隆抗體奠定了基礎。唐美瓊等[17]研究表明三七PnPR10-1 基因在1～3 年生三七的根、莖、葉中表現為組成型表達，且響應三七根部根腐病病原菌脅迫，提示三七PnPR10-1 可能具有代謝調控、生長發育和抗病等重要生物學功能，并參與抗三七根腐病的防御反應。

研究表明，三七病程相關蛋白基因PnPR1[18]、PnPR10[19]、PnPR10-3[20]、PnPRlike[20]、三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因PnPGIP[21]、三七幾丁質酶基因PnCHI1[22]、三七snakin 基因PnSN1[23,24]、三七defensin 類似蛋白基因PnDEFL1[24]、三七dirigent 基因PnDIR1[25,26]、三七抗病相關基因PnMAPKK1[27]、三七osmotin-like protein 基因PnOLP1[28]、三七NAC 轉錄因子基因PnNAC1[29]和三七轉錄因子基因PnMYB2[30]等表達受茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,MeJA）、乙烯利（Ethree,ETH）、H2O2和水楊酸（Salicylic acid,SA）4 種逆境脅迫相關信號分子的誘導，且大部分基因響應根腐病病原菌的侵染；在洋蔥表皮細胞中瞬時表達亞細胞定位載體，表明PnMYB2[30]和PnWRKY9[31]定位于植物細胞核，PnMAPKK1[27]、PnPR10-3[20]和PnPRlike[20]定位于細胞質，PnCHI1[32]、PnSN1[23,24]、PnDEFL1[24]、PnDIR1[25,26]和PnOLP1[31]定位于細胞壁；平板抑菌試驗表明PnCHI1[32]、PnDEFL1[24]、PnDIR1[25,26]、PnOLP1[28]、PnPGIP[33]、PnPR10[19]、PnPR10-2[34]、PnPR10-3[20]、PnPRlike[20]、PnSN1[23,24]和PnWRKY9[31]等基因的體外重組蛋白對腐皮鐮刀菌（Fusariumsolani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）等病原菌的菌絲生長具有抑制作用；除了PnPR10、PnPR10-2 和PnNAC1 在煙草中過表達其他基因，顯著提高了煙草對腐皮鐮刀菌（F.solani）的抗性，推測這些基因參與三七對根腐病菌的防衛反應有關。

人參PR10 是一個多基因家族，PgPR10 蛋白有4個亞型，且該基因家族具有組織特異性功能[35]。此前報道，人參PgPR10 蛋白家族基因具有核糖核酸酶活性[36]。人參PgPR10-1 基因定位于細胞質和細胞核中，在擬南芥中過表達后，植株對尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）等抗性增強。蛋白質相互作用表明PgPR10 蛋白可能在不同細胞間形成多聚復合體，在發育和防御相關機制中發揮作用。人參中PR10 的兩個同源基因PgPR10-1 和PgPR10-2 在不同真菌脅迫下具有特定的功能，轉錄水平上，PgPR10-1 對絲核菌（Rhizoctonia solani）較敏感，PgPR10-2 對灰霉菌（Botrytis cinerea）和膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）較敏感[37]。Pulla 等[38]最初報道PgPR10-2 響應對各種非生物和生物脅迫，人參PgPR10-2 基因在根中表達豐富，其轉錄本對多種病原菌和非生物刺激均表現出上調，可能是通過調節核糖核酸酶活性在轉基因煙草抗生物和非生物脅迫的防御反應中發揮作用。人參PgPR10-4 基因定位于細胞質，且擬南芥的轉基因株系抗真菌活性增強，該基因可能通過JA 信號通路參與相關的防御反應[39]。王敏[40]的研究同樣表明人參PgPR10 對人參根腐病、立枯病和黑斑病等多種病害病原菌有抑菌活性。KIM等[41]首次從人參中分離得到PR4 基因家族的基因PgPR4，該基因屬于PR4 基因家族的第Ⅱ類，PgPR4 在根中高水平表達且在病菌侵染和鹽脅迫下表達上調，表明PgPR4 可能在人參對致病菌的防御反應中發揮作用。孫天霞[42]發現轉人參防御素基因PgPR12 和人參脂質轉移蛋白基因PgPR14 的擬南芥對尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和毀滅柱孢菌（Ilyonectria destructans）的抗性都較野生型植株強。

Gayathri 等[43]發現人參PgPGIP 基因響應多種真菌侵染，具有廣譜的抑菌活性。有研究表明，含人參PgPGIP1 基因的轉基因小麥株系對根腐病和全蝕病的抗性明顯增強，說明人參PgPGIP1 基因在抗根腐病中發揮重要作用[44]。楊珊珊等[45]和Yang 等[46]首次克隆出西洋參根腐病抗性相關基因PqDELLA1，發現該基因響應腐皮鐮刀菌（F.solani）的侵染，同時還發現西洋參PqbZIP1 轉錄因子可能介導多種激素信號通路來調節西洋參根腐病抗性。PqERF1 基因可能參與西洋參的抗病防御反應[47]。初旸等[48]以人參全基因組草圖為基礎，預測出7 個人參抗病相關基因家族，共1 652個基因。尹銳[49]鑒定了人參NBS（PgNBS）類抗病基因，為人參抗病育種奠定了基礎。

2 轉錄組學

轉錄組學是指在整體水平上研究細胞中基因轉錄情況及轉錄調控規律，近年來有關藥用植物轉錄組學的研究越來越多，包括不同部位、不同年限、不同品種以及不同處理等轉錄組學研究，獲得了豐富的基因信息，為解析植物代謝調控機制、開發分子標記、品種改良和抗病育種等奠定了堅實的基礎[50]。

有研究表明，外源茉莉酸（Jasmonic acid,JA）和水楊酸等信號分子處理能夠增強植物的抗病性[51]。通過對腐皮鐮刀菌（F.solani）侵染的茉莉酸甲酯預處理后三七進行轉錄組分析，探究外源茉莉酸甲酯誘導三七抗腐皮鐮刀菌（F.solani）的分子機制，發現茉莉酸甲酯處理可誘導萜類化合物合成，參與對病原菌的防衛反應，茉莉酸和乙烯信號通路可能協同作用，積極調節三七對腐皮鐮刀菌（F.solani）的防御反應。另外，WRKY轉錄因子在植物抵抗病原菌侵染的防御反應中發揮重要作用，三七WRKY 基因參與三七對腐皮鐮刀菌（F.solani）侵染的防衛反應[30,34,52]。

對于銹腐病菌（I.destructans）侵染人參后不同時間點的轉錄組分析，發現乙烯應激反應、茉莉酸介導的信號通路等次生代謝活動與抗真菌防御反應協同作用，抵御病原菌侵染。銹腐病菌（I.destructans）會影響寄主人參的光合作用以及皂苷合成途徑，侵染后期大部分活性氧相關基因參與了病原菌誘導的氧化損傷反應，在中后期還影響人參的細胞周期和蛋白質翻譯；同時發現了447 個基因在侵染后表達，這些基因可能對抗病性具有重要意義[48,53]。在尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）侵染人參的過程中，PgSODs轉錄水平被高度誘導，在72 h 達到最高水平，PgCAT 在6 h 表達最高，并隨著時間的推移逐漸下降，PgGPXs 和PgGS 的表達量在24 h 增加了3 倍，并維持到72 h，PgAPX 的表達量沒有明顯的變化[54]。根據人參和人參銹腐病菌（I.robusta）相互作用過程中的轉錄組數據，發現真菌細胞在侵染人參細胞后逐漸恢復正常表達水平，而宿主人參細胞中雖然存在一個相對較長的持續防御過程，但是在感染過程中持續受到抑制[55]。

孫天霞[42]建立了不同時期、不同部位的人參轉錄組數據庫，時空關聯分析篩選出18 個與人參抗脅迫相關的基因。在人參展葉期，莖中的抗脅迫基因表達較多，在參根生長期根部抗脅迫基因表達較高，包括PRs和LRR 等。張晶晶[56]在抗感根腐病人參組織中發現了8 096 個差異基因。不論是抗感根腐病的組織還是病原菌侵染前后的組織，在轉錄水平上，差異表達的基因大都富集在植物－病原體相互作用途徑、植物激素信號轉導、次級代謝物的生物合成和苯丙烷代謝等途徑中，這些通路可能和抵抗病原菌侵染有關，但具體的作用機制還有待進一步研究。

3 蛋白質組學

蛋白質組學是對生命周期中特定時刻的細胞、組織、器官或有機體中存在的蛋白質進行的系統研究[57]。植物蛋白質組學是蛋白質組學的一個分支，植物受到病原菌侵害時，通過改變蛋白質的表達來完成信號的傳遞，引起防御反應，所以植物的抗病性和蛋白質數量、功能密切相關，通過蛋白質組學技術對差異蛋白進行定性定量分析是研究植物抵抗病原菌侵染作用機制的重要手段之一[58]。

人參紅皮病干擾了碳素代謝，影響了人參營養物質和活性成分的生物合成，降低了人參的成活率和藥用價值，紅皮病植株較健康植株有137 個差異蛋白，大多與碳素代謝、氧化還原平衡和抗逆性相關，這些差異有助于進一步探究紅皮病的致病機理[59]。孫嘉曼[60]通過雙向電泳技術鑒定外源水楊酸誘導以及人參銹腐病菌（I.destructans）侵染人參的差異表達蛋白，檢測到24 個豐度變化大、重復性好的差異表達蛋白，經過質譜鑒定得到22 種蛋白質，包括防衛反應、能量代謝、信號轉導、蛋白合成與代謝和光合作用等相關蛋白。蔡靜等[61,62]對抗根腐病及感根腐病的三七根部進行了蛋白質圖譜分析，在抗病根系中發現一種分子量為28.9 kD的蛋白質，該蛋白對三七根腐病病原菌（F.solani）的生長有抑制作用，可能與抗病性有關，另外還發現了一種可用于三七根腐病免疫診斷工具的單克隆抗體Mab7。

4 代謝組學

代謝組學是系統生物學的組成部分，是對生物體內的所有代謝物進行定性定量分析的技術，同時，可與生物體的生理病理變化進行關聯分析，進一步探究其作用機制。它廣泛應用于微生物學、農學、食品科學和臨床診斷等領域[63,64]。

植物的根系分泌物會有選擇地匯集有益或有害微生物，調控根際微生物環境[65]，Xie 等[66]從豌豆根系分泌物中分離純化出具有極性附著活性的阿拉伯半乳糖蛋白，它可能對豆科根瘤菌在豆科植物和非豆科植物根部的生長具有重要意義；Chaparro 等[67]研究表明擬南芥在不同的發育階段產生的根系分泌物有顯著差異，可能是為了執行特定的功能，這有助于協調根際環境。因此，研究人參屬藥用植物根系分泌物的成分及其與病原菌的關系，可以為探究植物與病原菌的互作機制提供理論依據。

張愛華等[68,69]通過毛細管電泳法測定人參根系分泌物表明，人參根系分泌的糖類和氨基酸類對人參細菌性軟腐菌（Erwinia carotovora）有趨化作用，表現為高濃度抑制病原菌生長，低濃度促進病原菌生長，并且多種人參皂苷在一定濃度下都對人參主要土傳病害病原菌的生長有促進作用。匙坤等[70]發現低濃度的人參總皂苷對根腐病致病菌有化學趨向性，說明人參根系低濃度的皂苷分泌物有可能促進了病原菌在人參根部的聚集和定植并侵染人參。

羅麗芬等[71]利用色譜—質譜聯用儀發現，三七根系分泌物主要包括酸類、醇類和糖類等9 類物質，且根系分泌物能促進根腐病菌腐皮鐮刀菌（F.solani）和惡疫霉菌D-1（Phytophthora cactorum）的生長，還能夠誘導芽管的生長方向。同時，研究還發現，隨著三七的生長，根際真菌和細菌群落發生了變化，一些土傳病害的病原菌如尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和腐皮鐮刀菌（F.solani）等顯著富集，而芽孢桿菌（Bacillusspp.）和木霉菌（Trichoderma.）等有益菌則受到明顯抑制，最終在土壤和植物之間形成了惡性循環[72]。趙靜等[73]在三七重茬地根際土壤中檢測到的苯甲酸及其衍生物等化感物質對三七根腐病菌的生長表現出低促高抑現象。三七的一些皂苷比如R1和Rb1，三七鮮根提取液及低濃度的三七總皂苷能促進根腐病病原菌的生長，進而引起根腐病的發生[74,75]。

任緒明等[76]采用高效液相色譜法研究表明，西洋參根中三七素（β-ODAP）含量的積累與西洋參根腐病的發生呈正相關，且β-ODAP 也在許多人參品種中存在，與人參根腐病的關系有待進一步研究。Nicol等[77]研究發現，人參皂苷能夠促進惡疫霉菌D-1（P.cactorum）和畸雌腐霉菌（Pythium irregulare）的生長，并抑制鉤狀木霉（T.hamatum）的生長，這可能與西洋參的連作障礙有關。這與蔣景龍等[78]認為的人參皂苷積累的差異可能和西洋參根腐病有關相一致。同時，焦曉林等[79]研究表明，皂苷提取物濃度達40 mg/mL時，對多種根腐病病原菌有顯著抑制作用，且西洋參根內酚酸物質及人參皂苷含量增加與西洋參發生根腐病時的防衛反應相關。董艷鑫等[80]發現健康和患根腐病西洋參根水提物的化感作用存在差異，表明西洋參根腐病與自身代謝差異性有關，為進一步查找差異化感物質提供依據。有機酸對很多藥用植物有化感自毒作用，多種酚酸類物質處理后會導致人參銹腐病發病率升高，且能促進根腐病病原菌的生長[81,82]。李麗等[83]分析4 年生健康西洋參和患根腐病西洋參根際土壤差異代謝物，差異代謝物顯示與健康組相比患病組中有機酸含量顯著升高，一些糖類物質含量顯著降低，可能與根腐病菌的生長有關。

5 問題與展望

隨著人們對中藥類健康產品需求的持續增長，各種人參屬中藥材都有著廣闊的應用前景，但病蟲害問題嚴重。藥用植物抗病育種工作起步較晚，缺乏系統研究，而且其遺傳背景復雜，育種周期長，今后應更加注重種質資源的收集與評價，使資源得以更加充分的利用。隨著科技的發展，分子標記輔助育種技術可以加速育種進程，組學技術為大規模地獲取植物基因序列信息、基因調控、蛋白表達以及代謝產物的變化提供了強有力的支撐。應將多組學技術綜合應用于藥用植物的抗逆品種選育中，對植物群體進行多組學方面的深入研究，篩選抗病資源，挖掘抗病基因，解析抗病基因轉錄調控機制，解碼抗病蛋白表達譜，鎖定抗病代謝物，培育對根部病害具有高抗性的品種，助力人參屬藥用植物的可持續發展。