茶樹響應低溫脅迫的分子機制研究進展

徐曉瑩，黃文尉，張麗霞

山東農業大學 園藝科學與工程學院，山東 泰安 271018

茶樹[Camelliasinensis（L.）O.Kuntze.]是我國具有傳統優勢的重要經濟作物，具有喜溫暖濕潤氣候的特性，因此低溫是茶葉生產極易遭遇的非生物脅迫之一。低溫脅迫可根據低溫程度的不同分為冷害（0～10℃）和凍害（＜ 0℃）兩個類型。環境溫度的波動會引起植物細胞膜流動性的改變，而低溫可導致細胞膜硬化并造成細胞骨架的重排，繼而引發貯存于細胞液泡中的Ca2+流向細胞質，觸發低溫響應。茶樹感受冷信號后，胞內Ca2+和ABA等第二信使可接收低溫信號并繼續將其向下游傳遞，最終引起茶樹抗寒性能的提高。

為了減輕低溫脅迫對茶樹生長發育和茶葉產量、品質的影響，我國茶葉科技工作者開展了茶樹抗寒品種選育、茶樹抗寒生理生化機理等研究，并取得了一系列進展[1-4]。近年來，為了給抗寒茶樹種質資源評價和抗寒茶樹品種分子育種提供有價值的遺傳信息和基因資源，茶葉科技工作者對茶樹響應低溫的分子機制進行了深入研究。目前，已鑒定了大多數與茶樹響應低溫信號相關的組分基因及其轉錄因子，同時對其在不同耐寒品種、組織中的表達差異以及與低溫脅迫的響應關系進行了研究。

本文重點對近年來在茶樹中鑒定的參與低溫脅迫響應的信號轉導組分和轉錄調控因子的種類與功能進行綜述，同時簡要介紹茶樹響應低溫脅迫的轉錄后調控和翻譯后修飾，并提出今后的研究重點。

1 茶樹響應低溫信號傳導途徑中的組分

目前在植物響應低溫過程的研究中了解較為清晰的冷信號傳遞途徑有兩個，即鈣依賴型信號傳遞途徑和ABA依賴型信號傳遞途徑。在鈣依賴型信號傳遞途徑中，Ca2+作為植物信號轉導途徑中的第二信使，通過與胞內Ca2+信號受體相結合，從而將環境中的低溫信號轉變為胞內信號，進一步誘導抗寒相關基因的表達。在ABA依賴型信號傳遞途徑中，低溫脅迫會引起植物自身ABA的累積效應[5]，ABA可間接激活ABA應答元件結合蛋白（ABA responsive element binding protein，ABRE）/（ABRE binding factors，ABF），該蛋白可調控ABA響應基因的表達，最終提高植物對低溫環境的適應能力[6]。

1.1 茶樹低溫響應途徑中的鈣信號受體

目前已知的Ca2+信號受體包括鈣調蛋白（Calmodulin，CaM）、類鈣調蛋白（CaM-like protein，CML）、鈣調磷酸酶B類蛋白（Calcineurin B-like protein，CBL）和Ca2+依賴蛋白激酶（Ca2+-Dependent protein kinase，CDPK或CPK）等。

在低溫脅迫下，茶樹葉片中CsCaMs基因表達量逐漸上升，而在被鈣調素拮抗劑處理過的葉片中該基因的表達被抑制，由此可以間接說明鈣調素參與調控茶樹低溫響應并發揮重要作用[7]。崔橋云[8]克隆了5個茶樹CML基因，除CsCML18-1僅有1個EFBD結構域外，CsCML16、CsCML18-2、CsCML42和CsCML38這4個基因都具有2個Ca2+保守結構域，且這4個基因在低溫脅迫下均表現為上調表達。陳思文等[9]研究發現，茶樹CsCML16蛋白與擬南芥、小麥等的類鈣調蛋白具有高度同源性，且在細胞膜和細胞核中均發現了CsCML16蛋白分布，這表明該蛋白可能在細胞膜信號轉導和調控核基因表達水平過程中發揮關鍵作用。

茶樹CsCIPK基因響應低溫脅迫且其表達具有組織特異性，在莖和根中表達量明顯高于葉中的表達量[10]。馮霞等[11]的研究發現，CsCIPK12具有與CBLs結合的結構域，其表達受低溫強烈誘導，可能通過參與糖和ABA等信號途徑調控茶樹響應低溫脅迫的生理過程，同時有關其具體的調節途徑和作用機理的研究有待進一步開展。

低溫脅迫處理下，茶樹CsCDPK在處理24 h后開始顯著上調表達，且隨著低溫脅迫處理時間的延長，72 h時CsCDPK的表達量與對照組相比上調了約5.1倍[12]，而CsMAPKK3基因的表達量呈顯著下調趨勢，在處理24 h時降到最低值[13]，這表明兩基因均響應低溫脅迫，但其表達產物的具體相互作用及調控機制還需深入研究證明。

1.2 茶樹低溫響應ABA信號途徑組分

在ABA依賴型信號傳遞途徑中，核心組分包括三類物質：ABA受體PYLs（Pyrabactin resistance1/PYR1-like/regulatory components of ABA receptors，PYR/PYL/RCAR）、蛋白磷酸酶2C（2C type protein phosphatases，PP2C）家族蛋白和蔗糖非酵解型蛋白激酶2s（Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2s，SnRK2s）。

張永恒等[14]克隆了茶樹SnRK2家族的兩個基因CsSnRK2.1和CsSnRK2.2，與煙草、小麥等作物的SnRK2基因都被低溫持續誘導不同，CsSnRK2.1和CsSnRK2.2僅在低溫處理4 h時上調表達，這表明這兩個基因雖參與低溫脅迫響應，但很可能不是關鍵基因。同時，SnRK2可以通過ABA依賴和ABA非依賴兩條途徑參與非生物脅迫響應[15]。研究表明：ABA處理24 h內，CsSnRK2.1能被ABA誘導上調表達，而CsSnRK2.2表達水平始終無顯著變化，表明CsSnRK2.1可能參與了ABA依賴的信號傳遞，而CsSnRK2.2主要通過ABA非依賴途徑參與植物響應脅迫過程。

2 茶樹低溫信號應答中的轉錄因子

轉錄因子是目前抗寒研究的熱點[16]，它一般包含DNA結合域、轉錄功能域、核定位信號和寡聚化位點等4個結構域，可被上游磷酸化信號激活并結合在靶基因的啟動子序列上，從而調控抗寒基因的表達。目前，ICE-CBF-COR低溫信號通路在模式植物擬南芥中的研究已較為清晰，這為其他植物抗寒分子機制的研究提供了必要的理論基礎[17]。在茶樹中，近年來已鑒定的響應低溫轉錄因子包括ICE-CBF-COR信號途徑中的ICE及CBF；此外，還包括響應低溫脅迫的WRKY、NAC、TIFY等轉錄因子。

2.1 ICE-CBF-COR信號通路中的轉錄因子

冷調控基因（Cold-regulatedgene，COR）是在低溫條件下大量表達的一類基因，也被稱為“低溫誘導基因”，其表達產物對細胞膜系統起到穩定作用，在植物響應低溫脅迫中發揮著重要作用[18]。在COR啟動子上含有C-端重復/脫水應答元件（C-repeat/dehydration responsive element，CRT/DRE），C-端重復結合因子/脫水應答元件結合因子（C-repeat binding factor，CBF/dehydration responsive element binding factor，DREB）可與之特異性結合，從而激活或抑制COR基因的轉錄表達。同時，CBF/DREB調控基因的表達又受到ICE（Inducer of CBF expression）轉錄因子的調控，從而形成ICE-CBF-COR低溫信號響應通路。

2.1.1 CBF/DREB轉錄因子

CBF/DREB是一類隸屬于AP2/ERF（APETA LA2/ethylene-responsive factor）家族的轉錄因子[19]，具有AP2（APETALA2）保守結構域，該結構域能夠特異性結合靶基因啟動子上的CRT/DRE元件，從而調控基因的表達[20]。在植物中主要存在不依賴CBF/DREB和依賴CBF/DREB的兩種低溫調控機制，且后者在擬南芥等模式植物中研究較深入[21]。

目前探明的茶樹CsCBFs基因家族有5個成員，低溫脅迫下CsCBF1、CsCBF2、CsCBF3和CsCBF5均有不同程度的響應，而CsCBF4無顯著差異表達，且隨著處理時間的延長，CsCBF1、CsCBF2、CsCBF3和CsCBF5等4個基因的表達量呈明顯上調趨勢。但不同茶樹品種之間存在較大差異，抗寒性強的茶樹品種CsCBFs上調幅度顯著高于抗寒性弱的茶樹品種。冷馴化處理具有同樣的變化規律，但14 d的最大表達量高于低溫脅迫[22]。以上結果表明除了CsCBF4外，茶樹其他CsCBFs基因在茶樹抗寒方面均發揮重要作用。馬寧[23]通過酵母單雜交試驗證明CsCBF3蛋白具有轉錄激活活性，且能與調控低溫、脫水等逆境的基因啟動子上的順式作用元件CRT/DRF元件特異性結合。Ying Yin等[24]的研究證實，茶樹CsCBF3基因能被低溫以及ABA、干旱誘導，將CsCBF3基因在擬南芥中過表達后，下游AtCOR15a和AtCOR78被誘導表達，與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥的耐寒性增強。以上結果有效驗證了CsCBF3在應對冷脅迫方面的重要作用。劉志薇等[25]從茶樹品種‘迎霜’中克隆得到CsDREB-A4基因，低溫脅迫處理下該基因在3個茶樹品種（‘迎霜’‘安吉白茶’和‘云南十里香’）中均有響應，但響應水平存在明顯差異，該研究證明了CsDREB-A4轉錄因子在茶樹抗低溫脅迫過程中的調控作用的重要性和復雜性。

2.1.2 ICE轉錄因子

ICE（Inducer of CBF expression）是一種MYC類轉錄因子，含有bHLH（Basic/helix-loophelix）結構域，該結構域可與含有MYC順式作用元件的CBF3基因特異性結合，從而激活CBF3基因的轉錄表達[26]。

尹盈等[27]研究表明，CsICE基因定位于細胞核且普遍存在于茶樹各種組織，但其在茶樹葉片中的表達量顯著高于根、莖、果中的表達量。在低溫脅迫下，茶樹葉片中CsICE基因可被快速誘導表達且表達水平顯著上調，在低溫處理2 h時高達對照水平的20倍。此外，隨著低溫脅迫處理時間的延長，CsICE基因表達量整體呈現先上升后降低的變化趨勢，推測下游基因的上調表達可能存在對CsICE的反饋調節。林鄭和等[28]克隆得到茶樹CsICE1基因和CsCBF1基因，研究發現低溫脅迫初期兩個基因的表達均顯著增強，表明兩個基因均響應低溫信號，對茶樹適應寒冷和提高后期的抗凍性有著重要作用。

2.2 其他相關轉錄因子

COR基因表達除了受到CBF/DREB轉錄因子調控外，還有一些與CBF作用方式類似的冷誘導轉錄因子也能在低溫脅迫下誘導COR基因的表達[29]。下面介紹目前已探明與茶樹低溫脅迫響應相關的其他幾種轉錄因子。

2.2.1 WRKY轉錄因子

WRKY結構域家族蛋白含有由60個氨基酸組成的WRKY結構域，可依據其保守結構域的數目及鋅指結構類型分成GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ三類[30]。該類轉錄因子可以識別并結合靶基因啟動子區域的W-box（C/T）TGAC（T/C）作用元件[31]，從而激活或抑制下游抗寒相關基因表達，參與調節植物低溫響應過程。

Wang Y等[32]從茶樹中克隆得到1個GroupⅠ的WRKY基因CsWRKY2，研究結果表明低溫脅迫處理下該基因顯著上調表達。王鵬杰等[33]利用PCR技術從“鐵觀音”茶樹品種中克隆了GroupⅠ和GroupⅡ2個類型的WRKY基因各4個。在低溫脅迫處理0～12 h內，8個基因的表達量均表現上調趨勢，且其中5個上調顯著；而在處理12～72 h的過程中，除CsWRKY21和CsWRKY23兩基因仍有上調外，其余基因表達量均表現為顯著下調。王鵬杰等[34]還克隆了分別在老葉、花和根莖中高表達的GroupⅡb亞類的CsWRKY6、CsWRKY31基因和GroupⅡ c 亞類的CsWRKY48基因。這3個基因均被低溫（4℃）誘導上調表達，其中CsWRKY6和CsWRKY31的表達量在48 h達到最高，而在處理72 h時CsWRKY48達到其峰值，均顯著高于0 h處理。以上研究結果表明，上述CsWRKY轉錄因子均響應低溫脅迫，在茶樹響應低溫脅迫調控過程中起著重要作用。

2.2.2 NAC轉錄因子

NAC（NAM/ATAF/CUS2）轉錄因子是植物特有的最大轉錄因子家族之一，高度保守的NAC結構域位于NAC蛋白的N端，在識別和結合下游靶基因DNA序列和核定位方面起關鍵性作用[35]；C端為多變的轉錄調控區（Transcription regulatory region，TRR），可發揮轉錄激活或轉錄抑制功能。

王永鑫等[36]從茶樹材料克隆得到CsNAC1基因和CsNAC2基因，它們分別屬于NAP和AtNAC3亞家族成員。低溫脅迫可誘導‘迎霜’和‘安吉白茶’2個茶樹品種中的CsNAC1和CsNAC2基因上調表達，但由于茶樹品種和處理時間段的不同，兩基因的表達水平存在較大差異。周棋贏等[37]從‘舒茶早’茶樹基因組分離鑒定出108個CsNAC基因，分屬于16個亞類，其中ONAC022和NAP亞類成員最多。低溫脅迫下，CsNAC基因及其共表達基因在淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號傳導等與提高植物抗逆性相關的22條途徑中富集。低溫處理后，茶樹中絕大部分CsNAC基因都上調表達，而ANAC0063類、UN-2類的CsNAC大部分成員對低溫誘導處理無響應。與此同時，即使是同一類CsNAC成員，它們響應低溫脅迫時的表現也存在差異，并不表現為完全一致。以上研究表明，茶樹CsNAC轉錄因子家族中有部分成員參與了茶樹低溫脅迫調控，同時也反映出其調控的復雜性。

2.2.3 TIFY轉錄因子

TIFY蛋白因含有高度保守的TIF[F/Y]XG結構域而得名，是陸地植物所特有的轉錄因子家族[38]。根據其結構域類型，TIFY家族可分為TIFY、ZML（ZIM&ZIM-like）、JAZ（Jasmonate-ZIM-domain）和PPD（PEAPOD）4個亞家族，4個亞家族均含有TIFY結構域，除了TIFY亞家族外，其他三個亞家族各自含有獨特功能結構域[39]。

謝思藝等[40]鑒定了22個茶樹CsTIFY轉錄因子家族成員，一半以上的CsTIFY基因均含有脅迫反應元件，且低溫脅迫可誘導大部分CsTIFY基因上調表達，其中CsZML1基因表達量顯著提高，而且大部分CsTIFY轉錄因子定位于細胞核，推測CsTIFY蛋白可能與細胞核中的其他蛋白發生互作，從而共同調控低溫響應相關靶基因的轉錄表達。姚新轉等[41]鑒定了19個茶樹CsTIFY基因，包括2個CsTIFY、7個CsZML、8個CsJAZ和2個CsPPD基因。低溫脅迫下，CsTIFY都存在響應，但不盡相同，如CsTIFY8和CsTIFY11被誘導且顯著上調表達，隨著冷脅迫處理時間的延長，其表達量隨之增加，而TIFY2在不同時間段表達差異較小，CsTIFY6的表達水平則呈現先增加后降低的趨勢。

3 茶樹響應低溫信號的轉錄后及翻譯后調控

3.1 茶樹響應低溫的轉錄后調控

MicroRNA（miRNA）是一類長度在18～24個核苷酸之間的內源性非編碼單鏈小RNA，它通過降解靶mRNA（植物）或通過與靶mRNA的3'UTR（Untranslated region）結合（動物）來阻斷蛋白質翻譯，從而主要在轉錄后水平負調控相關基因的表達[42]。

謝小芳[43]篩選出27個低溫脅迫差異表達miRNAs，發現其中13個miRNAs對應的85個靶基因大部分為轉錄因子，并從中選擇5對miRNAs及其靶基因研究了其在低溫脅迫下的表達模式，其中miR156、miR164和miR396的靶基因分別為SPL6（SQUAMOSA promoterbinding-like）、NAC1和GRF8（growth regulatingfactor）轉錄因子，且3個miRNAs表達量均下降，而其對應的靶基因表達上調，由此表明這些miRNAs通過調控其靶基因的表達參與了茶樹抗低溫脅迫過程。張玥等[44]采用生物信息學分析方法共發現7條分屬于6個不同的miRNA家族的茶樹miRNA。靶基因預測分析表明：這7條miRNA可能調節有關新陳代謝、生長發育、脅迫應答過程的28種靶基因，其中miRNA319靶向調節一個TCP2轉錄因子，由此推測miRNA319通過誘導TCP轉錄因子降解從而在調控茶樹低溫響應過程中發揮關鍵性作用。

3.2 茶樹響應低溫的翻譯后調控

蛋白質翻譯后修飾在植物逆境分子調控過程中也充當不可或缺的角色。ICE1屬于組成型表達基因[26]，在植物組織中維持一定的表達水平，ICE1轉錄因子的調控主要受蛋白翻譯后的修飾調控，蛋白的磷酸化與去磷酸化調控其活性，蛋白的泛素化與類泛素化修飾調控其穩定性和豐度，進而協同調控其下游基因的表達。

岳川等[45]從‘龍井43’材料中克隆了CsSDIR1（Salt and drought induced ring finger1）基因，該基因與HOS1（Highosmoticexpression1）均屬于指環結構域的E3泛素連接酶基因。在低溫（4℃）脅迫條件下，CsSDIR1的表達受到明顯抑制，在處理后的3 h和9 h其相對表達量顯著低于對照。雖然目前還沒有直接證據表明抑制CsSDIR1基因的表達有利于CsICE1的穩定和保持其豐度，但有研究表明HOS1可將ICE1轉錄因子泛素化降解，從而降低該低溫響應通路下游的CBFs及CORs基因的表達水平，最終影響植物的抗寒性能[46]；而在HOS1突變體中，低溫脅迫處理條件下CBFs及其下游靶基因的表達量顯著上調。

4 總結與展望

在借鑒模式植物擬南芥及其他作物的低溫響應分子機制研究成果的基礎上，茶葉科技工作者對茶樹中響應低溫信號的組分和轉錄因子進行了較廣泛的研究，大部分相關基因得到鑒定，并探明了其在不同茶樹品種與組織中的表達特性，明確了與低溫脅迫之間的響應關系，由此在茶樹響應低溫脅迫的分子機制研究領域取得了重大進展。

同時我們也應看到目前有關茶樹響應低溫脅迫的分子機制主要集中在轉錄調控環節，轉錄后調控、翻譯后修飾以及表觀遺傳修飾等方面的研究相對較少甚至還未涉及。此外，乙烯、茉莉酸甲酯、赤霉素等植物激素也都參與茶樹對低溫的響應，低溫信號與植物激素的交互作用機制也有待于深入研究，在調控茶樹低溫耐受性上，不依賴CBF的下游信號通路還亟待挖掘。