基于高分辨質譜的食品致敏蛋白檢測研究進展

劉 楠，許利麗，張曉梅，宗愛珍，徐同成，尤艷莉，張鴻偉*，肖 晶

（1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264000；2.山東省農業科學研究院農產品加工與營養研究所，山東濟南 250000；3.青島海關技術研究中心，山東 青島 266100；4.國家食品安全風險評估中心，北京 100022）

目前，食物過敏疾病已被公認為是危害公共健康的重大問題。在發達國家，因食物過敏引起的哮喘及過敏性鼻炎等疾病的發生率逐年增高［1-2］。據聯合國糧農組織報告，在世界范圍內，90%以上的臨床過敏反應由8大類食物引起，包括甲殼類、魚類、花生、堅果、小麥、牛奶、雞蛋和豆類［3］。食物過敏影響1%～3%的成年人和4%～6%的兒童，且在過去的二十年中，該比例顯著增加。據報道，在亞洲，兒童食物過敏的患病率為1.11%～7.65%；流行病學研究顯示，在食物過敏的成年人中，中國的患病率為18%［4］，印度為1.2%［5］。

致敏原是指能夠使機體發生過敏反應的抗原，主要為大分子蛋白質或多肽，也包括一些小分子化合物等。本文主要探討蛋白質致敏原的檢測，為方便敘述，下文中致敏原主要指代致敏蛋白。致敏蛋白可分為水溶性蛋白（如清蛋白）、鹽溶性蛋白（如原肌球蛋白）、醇溶性蛋白（如α-醇溶蛋白）、酸堿溶性蛋白（如谷蛋白）等不同類型。目前國內外對于食品過敏尚無有效的治療措施，唯一有效的措施是對致敏原的嚴格預防，避免接觸致敏原或含有致敏原的產品［6］。因此，對食品致敏原進行有效、快速、準確的檢測具有重要的研究意義。根據檢測對象不同，目前，致敏蛋白的檢測技術主要分為兩大類：即針對編碼致敏蛋白質的核酸或致敏蛋白質本身進行檢測。針對核酸檢測的技術主要包括環介導等溫擴增、聚合酶鏈式反應（PCR）等；針對致敏蛋白質檢測的技術主要包括酶聯免疫吸附（ELISA）、免疫印跡、免疫層析、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）等［7-8］。基于核酸的檢測技術主要通過檢測DNA 達到檢測致敏原的目的，屬于間接檢測致敏原；基于免疫反應的食物致敏原檢測技術主要利用抗原和抗體的特異性結合，通過同位素、熒光、酶等標記技術放大信號實現食品致敏原的定性定量檢測，應用較為廣泛。然而，該技術的特異性和靈敏度主要取決于抗原、抗體的制備質量，檢測氨基酸序列高度相似的致敏蛋白時，會因存在交叉反應導致假陰性、假陽性結果。另外，ELISA 和PCR 方法均不能區分致敏原的蛋白種類和來源物種［9］。

LC-MS 技術是一種鑒定食品致敏蛋白的非免疫技術，具有靈敏度高、選擇性好、準確性強等優點，其中高分辨質譜技術（HRMS）在質量準確度和分辨率方面更具分析優勢，同時還具有全掃描、高通量、數據可回溯分析等特點，因此在食品致敏原檢測領域的應用越來越廣泛。本文對HRMS、基于HRMS技術的食品致敏蛋白檢測進行了綜述。

1 高分辨質譜

HRMS 技術能夠實現對樣品組分的高質量精度測量，按照質量分析器的類型，通常可分為磁質譜（MS）、飛行時間質譜（TOF MS）、靜電場軌道阱質譜（Orbitrap-MS）和傅里葉變換離子回旋共振質譜（FTICR MS）［10-11］。目前常用的HRMS 技術包括TOF MS 和Orbitrap-MS 等［12］。TOF 檢測器的基本工作原理是：電離源中運動的電子撞擊樣品，使其電離變成帶電離子后經脈沖電場加速進入漂移區，根據到達檢測器的時間，不同質量的離子按照m/z進行分離。TOF具有高質量精確度的特點，可以減少同位素離子的干擾，適用于復雜食品基質中致敏蛋白的檢測［13］。Orbitrap裝置用于捕獲圍繞一個中心電極旋轉的帶電離子，其質量分析器由一個中心紡錘形電極和電極外部左右兩個半電極組成。帶電離子以一定的初速度進入離子阱后，圍繞中心電極在水平方向做旋轉運動，同時在垂直方向做諧振蕩；通過檢測感應電流可得到時序信號，經傅里葉變換轉換為頻譜即得到樣品質譜圖［14］。

此外，目前可以采用串聯質譜借助碰撞誘導裂解等多種碎裂方式對同位素離子或碎片離子的精確質量進行測定，實現復雜食品基質樣品中致敏蛋白的鑒定分析。常見的聯用質譜儀包括四極桿-飛行時間質譜（Q-TOF）、四極桿-靜電場軌道阱（Q-Orbitrap）等［15］。不同的質譜串聯形式產生了數據采集模式的多樣性，其中數據依賴性采集模式（DDA）和數據非依賴性采集模式（DIA）是進行蛋白/多肽分析的主要數據采集技術。

2 基于HRMS技術的食品致敏蛋白檢測前處理

食品致敏蛋白的前處理一般包括提取純化和酶解兩個部分。通常，食品基質需進行一定處理，如研磨或粉碎制備成固體粉末或均質液體，并去除樣品中的脂質、色素等雜質。隨后根據致敏蛋白的類型，加入不同離子濃度、pH 值的緩沖液（如碳酸氫銨、Tris-HCl、硼酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液等）進行蛋白質提取［16-18］。Sathe等［19］將溶液中氯化鈉的離子濃度從0.2 mol/L提高到4 mol/L，使山核桃蛋白在緩沖液中的溶解度提高了9.2倍。

由于復雜的食品基質組分會影響色譜、質譜檢測的靈敏度，故需進一步對蛋白質粗提液進行純化。目前常見的蛋白質純化方法包括有機溶劑沉淀法、固相萃取法、磁珠捕獲法、親和層析法等［20-21］。Zhao 等［22］采用Na2CO3溶液和70%乙醇溶液提取小麥、燕麥、藜麥和蕎麥中的麩質蛋白，對比分析了不同來源麩質蛋白之間的交叉反應性。Mattarozzi等［23］對比分析了C18固相萃取柱、聚合物基體固相萃取柱和體積排阻純化柱對蛋白質回收率的影響，結果顯示采用體積排阻純化柱的樣品蛋白質回收率較高。趙鑫［24］使用免疫磁珠分離純化銀鱈魚肌漿蛋白和基圍蝦肌肉蛋白溶液，將小鼠單克隆抗人IgE 抗體和磁珠偶聯后與過敏患者的血清結合捕獲樣品中的未知致敏原，經HPLC-MS/MS 技術鑒定發現銀鱈魚體內的小血管抑制素結合蛋白是一種潛在致敏原。Xu等［25］采用親和層析法純化重組原肌球蛋白，根據致敏蛋白上的His 標簽可與鎳離子形成強配位鍵將目標蛋白保留在鎳離子親和層析柱上，通過調節洗脫緩沖液中咪唑的濃度來分離純化原肌球蛋白，并使用Q-TOF MS 對比分析了重組蛋白與天然蛋白的免疫特性。

對于高鹽溶性蛋白，如副肌球蛋白，為了保證其在溶液中的溶解性，需要在整個蛋白純化過程中保持0.5 mol/L的鹽緩沖液體系不變。然而當鹽濃度過高時，普通離子交換層析（DEAE-Sepharose 及QSepharose Fast Flow 等）方法的吸附和洗脫效果將受到嚴重影響，而羥基磷灰石層析柱可耐受高鹽濃度，其填料中的鈣離子可與帶負電荷的蛋白以金屬螯合的方式結合，并可利用磷酸鹽緩沖液洗脫體系對吸附的目標蛋白進行分段洗脫，根據吸收峰將每段洗脫液進行收集、驗證，即可獲得目標蛋白［26］。對于復雜食品基質，脂肪、碳水化合物、蛋白質和水等組分之間會發生相互作用，且基質組分和加工時的相互作用等因素會影響食品致敏原的檢測。在致敏原檢測過程中，抽提食品中致敏原的同時會帶來其他蛋白質或組分，影響親和材料與致敏原間的結合，該現象稱為基質效應（Matrix effect），因此在檢測方法的研究中必須細致評估食品基質的影響及優化抽提條件。Tiwari 等［27］對不同類型食品基質中苦杏仁球蛋白的回收率進行評估，發現乳制品、堅果和蔬菜基質中苦杏仁球蛋白的回收率較高，而茶葉、糖果和水果基質中該蛋白的回收率較低，表明不同食品基質對致敏蛋白檢測產生的干擾程度差別較大。Bignardi等［28］使用Bio-Spin尺寸排阻色譜柱對餅干和黑巧克力樣品中的致敏蛋白進行分離富集，實現了堅果類（腰果、榛子、杏仁、核桃和花生）樣品中致敏蛋白的高靈敏度檢測。然而，目前對簡單食品基質（如牛奶、雞蛋、魚、蝦等）和復雜食品基質（如面包、餅干、披薩等）樣品中致敏蛋白的提取純化仍存在提取時間長、富集效率低等問題，需要進一步深入研究。

在基于質譜鳥槍法技術的分析中，致敏蛋白被酶解成小分子肽段，經色譜分離后進行質譜分析。通常，胰蛋白酶作為蛋白質酶解消化的特異性裂解酶，需在37 ℃下孵育12～18 h。為了縮短孵育時間，固定化胰蛋白酶是游離胰蛋白酶的合適替代品，可將孵育時間縮短至15 min［29］。Mattarozzi等［23］對比分析了尿素、硫脲和十二烷基磺酸鈉（SDS）對蛋白質酶解效率的影響，結果表明蛋白質在終濃度為6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲和2 g/L SDS變性劑的環境中經還原和烷基化變性后的酶解效率較高。

3 基于HRMS的食品致敏蛋白檢測

3.1 分析策略

質譜蛋白質分析主要包括“自上而下（Top-Down）”和“自下而上（Bottom-Up）”兩種分析策略［30］。Top-Down 方案是一種直接檢測致敏蛋白的方法，蛋白經十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）、二維凝膠電泳（2-DE）和液相色譜或毛細管電泳（CE）分離，直接導入質譜系統進行離子化碎裂，對完整蛋白和產生的碎片離子進行檢測，通過匹配相關數據庫如NCBI（https：//www. ncbi. nlm.nih.gov/protein/）和/或UniProtKB（https：//www.uniprot.org）對蛋白進行鑒定。該方法主要依據致敏蛋白的序列、分子質量及等電點等特征進行快速鑒定，能夠分析致敏蛋白的不同亞基和修飾后蛋白［31-32］。然而，該方案易受基質的影響，尤其在對加工后樣品的檢測中，會產生基質電離抑制效應；另一方面，由于基質的復雜性，易導致蛋白質的眾多峰疊加，無法有效對目標峰進行分離識別，如同位素差異蛋白的分析等。Top-Down方法無法實現致敏蛋白的高通量分析，且靈敏度及準確度不穩定，在應用中對致敏原的純度要求較高［33］。

由于Top-Down 方法的缺陷，質譜蛋白質檢測最常用的方法為Bottom-Up 方法，也稱為鳥槍法（Shotgun），該法普遍應用于致敏原的質譜定性和定量檢測［34］。其原理是先將蛋白質特異性酶解成小分子肽段，再根據多肽的極性進行色譜分離，離子化后質譜檢測混合物中各種多肽的質荷比和強度信息，并使用蛋白鑒定軟件將生成的肽段二級圖譜與數據庫原蛋白質的理論酶切圖譜進行匹配，組合所鑒定出的多肽序列得到蛋白質的具體信息。目前該方法已被廣泛應用于致敏蛋白的定量檢測，尤其適用于復雜基質中致敏蛋白的分析［35］。

3.2 采集模式

基于HRMS 技術檢測致敏蛋白目前主要有DDA 和DIA 兩種采集模式［36］（圖1）。DDA 采集模式采用較窄的質荷比窗口對前體離子進行篩選，在滿足設定的響應閾值后可同時得到目標蛋白/肽段的一級質譜和碎片信息，隨后通過前體離子和碎片離子的精確質量數進行譜庫檢索鑒定。DIA 采集模式克服了DDA 采集數據記錄的局限性（表1），肽段在進行第一次m/z掃描后，所有選定m/z范圍內的母離子全部碎裂，子離子進行第二次m/z掃描［37-38］。

表1 DDA和DIA數據采集模式對比Table 1 Comparison of DDA and DIA data acquisition modes

圖1 DDA和DIA采集模式示意圖［36］Fig.1 Schematic diagrams of DDA and DIA acquisition modes［36］

連續窗口采集所有理論碎片離子質譜（SWATH-MS）技術是DIA 技術的一種，根據前體離子在整個質荷比范圍中的密度，將整個質譜掃描質量范圍分為若干連續變化的小窗口，并使每個窗口中的前體離子數目達到均衡，然后高速循環地分別對每個窗口的所有離子進行碎裂。理論上，SWATH采集模式一次進樣即可記錄樣品中化合物的所有碎片信息，然后通過目標數據提取方法進行分析［39］。這種采集模式的最大優勢在于，當有新的蛋白質/肽段或其他化合物被發現時，不需要重新進樣即可對數據進行回溯分析，這對于研究尚未完成基因組測序的非模式生物極其重要。Xu 等［40］采用SWATH-MS 方法對模擬胃腸液處理的不同來源原肌球蛋白中的特征多肽進行鑒定，通過與蛋白數據庫對比，結合細胞表位最終確定特征多肽為VEKDKALSNAEGEVAAL，該方法可用于鑒定不同來源原肌球蛋白的特征多肽。

3.3 致敏蛋白的檢測

致敏蛋白檢測中常用的定性方法為肽碎片離子鑒定法（PFF）和肽質量指紋圖譜法（PMF）［41］。PMF的理論基礎為：蛋白質經酶解為不同類型的多肽，獲得所有多肽的相對分子質量，所形成的專一性的、特異性的肽段分子質量圖譜即為肽質量指紋圖譜［42-44］。通過比對實驗得到的圖譜與蛋白質數據庫中的理論圖譜進行蛋白質鑒定，常用的蛋白數據庫包括Uniport（www. uniprot. org）、 NCBI（www. ncbi. nlm.nih.gov）等，匹配的肽段可借助ProteinPilot、MaxQuant等質譜數據庫檢索軟件進行分析。

PFF 方法使用串聯質譜將特定多肽進行碎裂，結合母離子峰分析相鄰同類型的峰質量差確定肽段的氨基酸殘基，并推算目標多肽的氨基酸序列。根據MS 檢測多肽的精準分子質量和MS/MS 所得的序列信息，結合蛋白質數據庫即可實現蛋白質的準確鑒定。該方法可以用來鑒定致敏蛋白的特征多肽［45-49］。

PMF 方法主要是一級質譜方法，容易受到食品基質效應的影響，如脂質等；而PFF 方法受到基質效應的影響較小，應用更為廣泛。

Zhao 等［50］采用TOF MS 技術檢測7 種魚類蛋白的交叉反應性，使用胰蛋白酶消化魚蛋白質提取液，并基于Bruke FlexAnalysis 和ExPASy蛋白質組學服務器FindMod工具對酶解多肽的峰質量和強度進行檢索分析，通過比較實際獲得的多肽質量與Swiss-Prot/TrEMBL 計算的理論多肽質量進行峰鑒定。Montowska 等［51］采用nano-LC-TOF MS/MS 方法檢測市售禽肉制品中功能性蛋白質添加劑衍生的非肉類蛋白，得到43條大豆蛋白、9條牛奶蛋白以及12條蛋清蛋白的熱穩定性特征多肽，其主要致敏蛋白來源包括大豆甘氨酸、牛奶αs1-酪蛋白、β-乳清蛋白、雞蛋卵轉鐵蛋白和溶菌酶C。

定量分析對深入分析蛋白質功能性具有重要作用，高效的液相色譜分離系統結合穩定精確的質量分析系統能夠實現致敏原組分準確、快速及高通量的定量分析。相對定量檢測方法可以通過穩定同位素標記法或無標記法對兩個以上樣品中致敏蛋白表達量的差異進行比較。穩定同位素標記法包括同位素編碼親和標記（ICAT）、同位素編碼蛋白標記（ICPL）、同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）、串聯質譜標記（TMT）等（表2）［52-54］。Gavage等［55］采用穩定同位素標記法比較了不同食品基質中雞蛋（卵清蛋白、卵轉鐵蛋白和卵黃蛋白-1）、牛奶（αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白）、花生（7S 球蛋白和11S 球蛋白）和榛子（11S球蛋白）中的致敏蛋白，實現了對餅干、巧克力和未烘烤的凍干曲奇餅干3種食品基質中8種致敏蛋白的同時高通量檢測。

表2 穩定同位素標記檢測方法對比Table 2 Comparison of detection methods for stable isotope labeling

相比之下，無標記技術在食品致敏蛋白定量檢測中的應用較為廣泛，通常采用DDA、DIA 兩種采集模式進行數據采集。Xu等［56］基于Q-TOF MS 質譜儀結合DDA 和DIA 采集模式對不同加工方式處理的蝦粗蛋白提取液進行檢測，評估蝦中4種致敏原（原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白輕鏈和肌漿鈣結合蛋白）胰蛋白酶消化酶解的多肽，并鑒定了一條來自精氨酸激酶的特征多肽（MGLTEFQAVK）。在質譜技術定性定量檢測方面，致敏蛋白特征多肽的篩選具有重要意義，此外，特征多肽的篩選可進一步與抗原表位匹配度相結合，以加強特征多肽在免疫學檢測方面的應用。

4 總結與展望

質譜技術應用于食品致敏蛋白檢測的靈敏度和準確度遠遠高于傳統的免疫學方法和PCR 方法。高分辨質譜技術在分辨率和質量準確度方面得到了進一步的提升，同時還具有全掃描、高通量的特點，因此在復雜食品基質的致敏原檢測中尤具優勢。但復雜基質食品中致敏蛋白的前處理仍面臨著巨大挑戰，后續研究需重點聚焦提高樣品前處理的效率，針對復雜基質食品和加工食品開發快速提取、純化富集致敏蛋白的方法；在致敏蛋白檢測方面，應重點關注其特征多肽的篩選和確定方法，提高復雜食品基質中致敏蛋白檢測的特異性和準確性。