可視化輔助雙碳點比率熒光檢測水中銀離子

韓 雍，馬艷鑫，汪 慧，王 雅

（1.隴東學院 農林科技學院，甘肅 慶陽 745000；2.蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

重金屬離子污染對生態環境和人類健康造成了嚴重影響。銀（Ag）是一種天然重金屬，主要以游離態存在于含銀礦石中，廣泛應用于化學、化學工程、攝影、珠寶、醫藥和電子電氣設備等領域［1］。因銀和銀基化合物在工業和日常生活中的廣泛使用而產生的大量銀離子（Ag+）廢液，加劇了環境污染。在生態系統中，Ag+通過食物鏈或直接通過飲用水進入人體，進而在人體內聚積，并導致嚴重的健康問題［2-3］。銀可破壞酶的活性并與各種代謝物結合，最終導致細胞毒性、器官衰竭和線粒體功能下降，其在人體內的蓄積可能會對人體健康造成嚴重的負面影響［4-5］。現有Ag+的檢測方法，如電化學法、電感耦合等離子體質譜法、原子吸收光譜法、中子活化分析法和X 射線熒光法等［6-7］，存在操作復雜、靈敏度低、成本高、對儀器設備精度和操作人員專業性要求高等局限。因此，開發高靈敏、高效便捷的分析方法準確檢測Ag+，對監測重金屬污染，保障人體健康具有重要意義。

光譜檢測法具有便捷高效的優勢，以半導體量子點（QDs）為基礎的熒光檢測方法顯示出良好的應用前景。碳點（CDs）作為一種新型有機量子熒光材料，因具有綠色合成、毒性低、生物相容性和水溶性好、穩定性高等優越性能而得到廣泛關注，是傳統有機染料和半導體量子點的替代物之一［8］。CDs憑借優良的熒光性質，在生物成像［9］、分析檢測［10］、催化［11］、納米醫學［12］、光電設備［13］等方面廣泛應用。由于檢測體系因素復雜，單發射CDs 熒光較難實現滿意檢測，而具有自校準特性的比率熒光探針因實時響應快、分辨率高、靈敏度高、具有較強的干擾能力而得到廣泛關注［14］。比率熒光探針是利用同一激發波長下兩個熒光發射峰的強度比進行檢測，可以限制內置背景干擾，提高信噪比，進而提高檢測靈敏度和準確性［15］。大多數用于Ag+檢測的熒光響應均基于單一的熒光探針，易受傳感器濃度變化、光源或檢測器漂移及復雜樣品中的環境等因素的影響［16］，而比率熒光傳感器可以避免這些問題。因此構建一種性能優異的比率熒光傳感器，并結合一些便攜設備用于環境水樣中Ag+的定量和可視化半定量檢測具有重大意義。

本工作構建了一種用于Ag+檢測的簡便、快速、靈敏、便攜和可靠的可視化比率熒光傳感器。首先通過水熱法分別以檸檬酸、L-半胱氨酸（L-Cys）和鄰苯二胺（OPD）為前體合成了藍光碳點（B-CDs）和黃光碳點（Y-CDs），隨后通過雜化使其形成雙碳點（d-CDs）。d-CDs 的熒光光譜在370 nm 下激發時產生420 nm 和560 nm 兩處發射峰，向該d-CDs 傳感器加入Ag+時分別能夠引起這兩處發射波長熒光強度的減弱和增強，為實現可視化半定量檢測環境水樣中Ag+的殘留量提供了理論依據。通過對d-CDs 的形貌、官能團和光學特性進行表征，分析了d-CDs對Ag+的熒光響應機制。并考察了d-CDs在環境水樣中對Ag+的檢測能力。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

檸檬酸、L-半胱氨酸（L-Cys）、鄰苯二胺（OPD）（上海阿拉丁化學試劑有限公司）；硝酸銀（AgNO3）、氯化鉀（KCl）、硫酸銅（CuSO4）、硫酸鐵（Fe2（SO4）3）、硫酸亞鐵（FeSO4）、氯化鈷（CoCl2）、硫酸鉛（PbSO4）、碳酸鈣（CaCO3）、硫酸鎂（MgSO4）、硝酸鋁（Al（NO3）3）、硫酸鋅（ZnSO4）、氯化鈉（NaCl）（天津市盛奧化學試劑有限公司）；乙醇、甲醇、丙酮、硼酸（天津市天力化學試劑有限公司）；磷酸（煙臺市雙雙化工有限公司）；冰乙酸、氫氧化鈉（天津市大茂化學試劑廠）；二氯甲烷（上海麥克林生化科技股份有限公司）；石油醚（天津市富宇精細化工有限公司）；三氯甲烷（白銀良友化學試劑有限公司）。以上試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

Talos F200S 透射電子顯微鏡（TEM，美國FEI 公司）；UV2300II 紫外-可見分光光度計（UV-Vis，上海天美科學儀器有限公司）；D8 X 射線衍射儀（XRD，德國Bruker AXS 公司）；ESCALAB 250Xi X 射線光電子能譜（XPS）、Nicolet iS20 傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）（美國Thermo Scientific 公司）；F97pro 熒光分光光度計（上海棱光技術有限公司）；ST2100 pH計（常州奧豪斯儀器有限公司）；KH5200DE超聲儀（昆山禾創超聲儀器有限公司）和H1850離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.3 B-CDs的制備

參考文獻方法制備藍光碳點（B-CDs）［17］：稱取1 g 檸檬酸和0.5 gL-Cys 于40 mL 超純水中混合，超聲使其完全溶解。將均質溶液轉移到50 mL 的四氟乙烯襯里反應器中，于180 ℃下反應2 h。室溫自然冷卻后，8 000 r/min 下離心15 min，將所得上清液用0.22 μm 微濾膜過濾，得到淺黃色B-CDs 溶液，于4 ℃條件下儲存，備用。

1.4 Y-CDs的制備

黃光碳點（Y-CDs）的合成參考文獻［18］并進行適當改進：將1 g OPD 溶于40 mL超純水中，超聲分散均勻。隨后將溶液置入高壓反應釜中，于180 ℃下反應4 h。冷卻至室溫后，8 000 r/min 下離心15 min除去沉淀物，用0.22 μm微濾膜過濾，濾液于4 ℃冰箱中儲存，用于后續實驗。

1.5 比率熒光傳感器的構建

將制備的B-CDs 與Y-CDs 分別稀釋500 倍和10 倍后按溶液體積比3∶1 的比例混合形成雙碳點（d-CDs），該d-CDs 的熒光光譜在370 nm 下激發時產生560 nm 和420 nm 兩處發射峰，此時熒光強度的比值為IF560∶IF420=1.8∶1。在2 mL pH 7.0 的Britton-Robinson（BR）緩沖液體系中，添加1 mL 不同濃度的Ag+標準溶液與1 mL 的d-CDs，室溫孵育45 min 后，于370 nm 激發波長下進行熒光測量并記錄B-CDs和Y-CDs的熒光強度（分別為IF420和IF560）。以Ag+標準溶液的梯度濃度為橫坐標，d-CDs的熒光比率IF560/IF420為縱坐標，繪制標準曲線。檢出限（LOD）由LOD=3ε/σ（ε與σ分別代表空白信號的標準偏差（n＞6）和標準曲線的斜率）進行計算。所有測量均進行3次平行實驗。

1.6 選擇性評價

為研究該傳感器對其他金屬離子的抗干擾能力，分別向傳感器溶液中加入干擾離子Al3+、Co2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Fe3+、K+、Mg2+、Na+、Pb2+和Zn2+，并記錄熒光強度比值IF560/IF420的變化。

1.7 實際樣品檢測

為了評估比率熒光傳感器在實際樣品檢測中的可行性和實用性，選擇湖水、自來水和礦泉水作為實際樣品，經過濾凈化后，向實際樣品中分別加入不同濃度的Ag+標準溶液并測量相應的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 形貌表征

采用TEM 對所合成的雙碳點d-CDs進行微觀結構研究，圖1A、B分別為d-CDs的TEM 圖像和粒徑分布圖。由圖1A 可知，d-CDs 呈球形，分散性好且分布均勻。圖1B 所示的粒徑范圍為0.63～3.52 nm，平均粒徑為2.14 nm。通過FTIR研究d-CDs的官能團結構，由圖1C分析可知，這些特征峰分別由O—H 的伸縮振動（3 368～3 204 cm-1），2 920、614 cm-1處C—H 的伸縮振動，2 585 cm-1處—SH，1 703、1 385 cm-1處C=O 的非對稱和對稱伸縮振動，1 497 cm-1處C—N 的彎曲振動，1 555 cm-1處苯環C=C的骨架振動，1 197 cm-1處C—O 的伸縮振動，829 cm-1處—NH2和743 cm-1處C—S 的拉伸振動所引起。上述結果表明d-CDs 中存在芳香族化合物的結構及親水性基團。圖1D 為d-CDs 的XRD 圖像，其在23.56°處出現較寬的衍射峰，說明d-CDs 具有無定形結構。另外出現的雜峰表明合成的碳點可能摻雜了其他雜質。

圖1 d-CDs的TEM圖像（A）、粒徑分布圖（B）、紅外譜圖（C）及XRD譜圖（D）Fig.1 TEM image（A），diameter size distribution curve（B），FTIR spectrum（C），XRD pattern（D） of d-CDs

通過XPS 進一步對d-CDs 的元素進行分析，圖2A 中以291.4、405.31、540.59 eV 為代表的特征峰，分別對應C、N 和O 三種元素。其中C1s 的高分辨光譜（圖2B）中顯示有3 個鍵 C—C/C=C（284.8 eV）、C—N/C—S（286.0 eV）和O—C=O（288.7 eV）；N1s的高分辨光譜（圖2C）中顯示兩種不同化學態的N，吡啶N（399.1 eV）和吡咯N（400.4 eV）；O1s 的高分辨光譜（圖2D）中顯示兩個O—C 鍵：C—O（531. 7 eV）、O—C（531. 9 eV）和一個C=O 鍵（533. 1 eV）。通過XPS 未能檢測出—SH，分析可能是—SH被氧化所致。XPS和FTIR圖譜結果說明所合成的d-CDs含有巰基和芳香環結構，另外大量羥基和羧基的存在使得d-CDs具有較好的水溶性。

圖2 d-CDs的XPS圖譜Fig.2 XPS spectra of d-CDs

2.2 光學性質

Ag+的紫外吸收光譜和d-CDs的熒光光譜圖如圖3A所示。由圖可知，Ag+在220 nm處有一個較強的吸收峰。另外在370 nm波長激發下，d-CDs分別在420 nm和560 nm處產生兩個發射峰。d-CDs溶液在日光燈下呈淡黃色，在紫外燈照射下發藍色熒光（圖3A 插圖）。圖3B 為d-CDs 在不同激發波長下的熒光光譜，激發波長在350～380 nm 范圍內變化時，420 nm 和560 nm 處的熒光強度隨著激發波長的增大分別呈現下降和增加的趨勢，但發射波長未發生位移。為更好地實現Ag+的可視化比率熒光檢測，選擇370 nm作為最適激發波長。

圖3 Ag+的紫外吸收光譜圖和 d-CDs的熒光光譜圖（A）及d-CDs 在不同激發波長下的熒光光譜（B）Fig.3 Absorbance spectrum of Ag+ and fluorescence spectrum of d-CDs（A） and fluorescent spectra of d-CDs excited at varying wavelengths（B）

2.3 檢測條件優化

為了提高所構建的d-CDs 比率熒光傳感器檢測Ag+的靈敏度，對pH 值、反應溫度和孵育時間進行了優化。

考察了不同pH 值（4.0～10.0）的BR 溶液對Ag+加入前后d-CDs 傳感器體系的影響。如圖4A 所示，在未加入Ag+時，pH 值的變化對熒光強度比值IF560/IF420幾乎無影響。加入Ag+并混勻孵育一段時間后發現，pH 4.0～6.0 范圍即酸性環境下，IF560/IF420先大幅度增加后趨于緩慢增加；在pH 6.0～7.0 范圍內，IF560/IF420顯著增加，并在pH 7.0 處達到最大熒光強度值，此時熒光強度具有較好的穩定性，故選擇pH 7.0作為體系的最適pH值用于后續實驗。

圖4 檢測條件的優化Fig.4 Optimizations of testing conditions

優化了d-CDs傳感器檢測Ag+的溫度（20、25、30、35、40、45 ℃）和孵育時間（0～85 min）。結果顯示，溫度對于熒光強度的影響不明顯（圖4B）。選擇0～85 min的孵育時間進行分析，結果如圖4C 所示，加入Ag+后，傳感器的IF560/IF420在0～45 min 之間急劇增加，45 min 后緩慢增加。表明起初隨著Ag+的加入，Ag+能夠快速與d-CDs傳感器體系表面的官能團結合，使熒光強度比值IF560/IF420增加，隨著Ag+與d-CDs 傳感器體系的逐漸接觸，d-CDs 傳感器對Ag+的檢測能力下降，導致IF560/IF420增加緩慢并趨于穩定。因此分別選擇室溫和45 min作為最適反應溫度和孵育時間進行后續實驗。

2.4 傳感器構建

為了探究該傳感器檢測Ag+的靈敏度，在最佳檢測條件下向所構建的d-CDs比率熒光傳感器中加入不同濃度的Ag+（0～40 μmol/L），分析其響應程度。結果如圖5 所示，隨著Ag+濃度的逐漸增加，體系在420 nm 處的熒光強度減弱，而在560 nm 處的熒光增強，熒光強度比值IF560/IF420與Ag+的濃度在0～40μmol/L 范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=0.004 04x+0.610 37，相關系數（r2）為0.996 7。由LOD=3ε/σ計算得到LOD為1.26 μmol/L。另外通過紫外燈照射，可以實現Ag+的可視化半定量檢測（圖5 插圖）。與其他已報道的檢測方法相比［19-23］（表1），本方法的LOD 并非最低，但本文所使用的碳點合成方法具有工藝簡單、原料低廉和操作方便等優勢，且可通過紫外燈照射實現Ag+的可視化半定量測定。

表1 不同熒光傳感器檢測銀離子對比Table 1 Comparison of different fluorescence sensors for Ag+ detection

圖5 d-CDs在不同濃度Ag+（0～40 μmol/L）中的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of d-CDs at different concentrations of Ag+（0-40 μmol/L）

2.5 選擇性評價

為了評估本研究所構建的d-CDs比率熒光傳感檢測方法的特異性，以濃度為1 mmol/L 的其他干擾離子Al3+、Co2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Fe3+、K+、Mg2+、Na+、Pb2+、Zn2+進行選擇性評價。在最優實驗條件下，向體系中加入1 mL 10 μmol/L Ag+和上述干擾離子，孵育45 min。結果如圖6 所示，在高倍濃度（100 倍）干擾離子存在時，該傳感器對干擾離子幾乎無響應，而對Ag+響應較明顯，表現出良好的選擇性。

圖6 d-CDs對不同離子的響應情況Fig.6 Response of d-CDs to different metal ions

2.6 d-CDs對Ag+的響應機理

FTIR 和XPS 分析結果表明，d-CDs 表面含有巰基基團、芳香環結構以及大量的羥基和羧基，金屬離子能夠與這些官能團結合形成復雜的網絡結構進而引起d-CDs 溶液的熒光猝滅。結合Ag+的紫外吸收峰與d-CDs的熒光光譜圖進行分析，推斷熒光共振能量轉移（FRET）和內濾作用（IFE）不是d-CDs識別Ag+的主要原因。在370 nm 激發下，體系中加入Ag+會引起d-CDs在420 nm 和560 nm 處的發射峰強度分別減弱和增強，表明Ag+在不同發射峰處的響應機理不同。Ag+能與d-CDs 表面含有的羥基、羧基發生官能團配位形成d-CDs/Ag+復合物，可能通過光致能量轉移（PET）猝滅d-CDs在420 nm 處的熒光發射，但560 nm 處的黃色熒光主要依賴于碳核發光，金屬離子對其影響較弱，故PET對黃色熒光發射無明顯影響［24］。隨著Ag+濃度的增大，d-CDs 溶液在365 nm 紫外燈下顯示出由藍色至黃色的變化，并觀察到溶液中產生絮凝物，推測是由于Ag+與d-CDs 表面的巰基結合導致碳點表面能量陷阱大量缺失，引起熒光猝滅；而Ag+對碳核560 nm 處的黃色熒光影響不明顯，故隨著藍色熒光的減弱，體系發光由黃色熒光主導，熒光發射明顯增強。由現有反應機理推測，該體系主要表現出420 nm 處的藍色熒光和560 nm 處的黃色熒光競爭發射的情況，在碳點比率熒光檢測金屬離子的應用方面具有一定的實踐意義。

2.7 實際樣品檢測

選擇湖水、自來水和礦泉水作為實際樣品，經離心過濾處理后，進行3 個不同濃度（0、5、10μmol/L）的加標回收實驗，結果如表2 所示。實際樣品的加標回收率為98.2%～105%，相對標準偏差（RSD）為0.49%～3.8%。結果表明該d-CDs比率熒光傳感器能夠可靠、有效地檢測實際樣品中的Ag+。

表2 實際樣品的加標回收率Table 2 Spiked recoveries of real samples

3 結 論

本研究通過將B-CDs 與Y-CDs 雜化形成d-CDs，構建了一種特異性識別Ag+的可視化比率熒光傳感器。通過對d-CDs 進行表征和光學特性分析，研究了其對Ag+的響應機制。結果表明，Ag+能與d-CDs 表面官能團發生配位形成d-CDs/Ag+復合物，推測可能是碳點表面官能團與金屬離子絡合產生的PET 猝滅了體系的藍色熒光。另外Ag+能夠與d-CDs 中的巰基結合產生絮凝物，隨著藍色熒光的減弱，體系呈現出黃色熒光增強的現象。將d-CDs 傳感器應用于環境水樣的檢測，加標回收率為98.2%～105%，方法檢出限為1.26 μmol/L。同時通過紫外燈照射可肉眼直觀半定量檢測Ag+。以上結果證實了所構建的可視化比率熒光傳感器檢測環境水樣中Ag+的可靠性與實用性。本探針設計簡便、靈敏度高、可靠性強，在現場快速檢測和資源匱乏地區水質檢測中具有較大的應用前景，并為未來紙基傳感器的研究提供了一定的理論依據。