膠體金免疫層析法快速檢測水產品中河豚毒素的研究

韓金治，李亞茹，羅 林，關 甜，雷紅濤，蔡偉誼，2，王炳志，徐振林*

（1.廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642；2.廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 510410；3.深圳市易瑞生物技術股份有限公司，廣東 深圳 518000）

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是一種低分子量的非蛋白類神經毒素，廣泛存在于鲀科魚體表及體內臟器中［1］，近年來在織紋螺、藍環章魚、海星等生物體內也檢測到TTX 的存在［2-4］。TTX 最早于20世紀初由日本化學家田原良純率先在河豚中發現［5］，被認為是海洋中最致命的毒素之一［6］。它通過選擇性阻斷神經、骨骼肌和心肌膜的電壓門控Na+通道的動作電位而起作用［7］，小鼠腹腔注射的半致死劑量（LD50）為10.7 μg/kg［8］。據報道，等量的TTX 的毒性為氰化物的數萬倍，對人體的致死劑量僅為0.5 mg［9］。由于TTX具有熱穩定性［5，8］，因此在一般的烹飪過程不會被破壞［10］。全球因食用水產品造成的河豚毒素中毒案例頻發［11-18］，除日本外，中國為全球河豚毒素中毒事件數量最多的國家（圖1［11］）。2016～2022 年廣東省衛生健康委員會相繼發布多起河豚毒素中毒事件（http：//wsjkw.gd.gov.cn/）。因此建立一種簡便、快速、靈敏、低成本的檢測方法對于防止河豚毒素中毒及中毒后的快速診斷都十分必要。

圖1 全球地圖-各國的病例分布Fig.1 Global map reporting the distribution per country of the cases included in the present study

目前，河豚毒素的檢測方法有生物檢測法［19］、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）［20］、超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）［21］、酶聯免疫法（ELISA）［22］、生物傳感器法［23-26］等。但生物檢測法存在個體差異；儀器分析法需要精密儀器以及專業人員，樣品前處理步驟復雜［27］；生物傳感器信號放大功能有限，且信號輸出不穩定，重現性差。以上不足使這些方法在現場快速檢測方面受到一定的局限，難以滿足市場應用的需求。相比于上述幾種方法，紙基的免疫層析方法具有簡單快速、特異性強、檢測時間短且成本低的優勢［28］，根據示蹤物［29］的不同可將其分為熒光免疫層析法、量子點免疫層析法、膠體金免疫層析法等。其中膠體金免疫層析技術因價格低廉、操作簡單、結果可視化等優點被廣泛運用于食品安全、環境監控、臨床診斷等領域［30-34］。早期Ling 等［35］利用實驗室獲得的高特異性河豚毒素單克隆抗體建立了一種檢出限為20 ng/mL 的膠體金免疫層析方法。Zhou 等［36］基于河豚毒素單克隆抗體并以TTX-BSA 為包被抗原制備了一種河豚毒素膠體金免疫層析試紙條，其可視化的檢出限為40 ng/mL。本課題組前期通過改良制備了抗河豚毒素的單克隆抗體，并構建了免疫傳感器［24］，雖然該法靈敏度很高，但實用性仍有待提高。

為了彌補國內當前河豚毒素商業化試紙條的空白，本研究基于前期制備的抗體，通過標記膠體金建立了免疫層析法，并系統對影響膠體金免疫層析法檢測性能和穩定性的條件以及樣品前處理方法進行優化，最后用于河豚魚、織紋螺等實際樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

樣品墊、硝酸纖維膜（NC 膜）、吸水墊和聚氯乙烯底板（PVC 底板）（上海金標生物技術有限公司）；樣品墊處理液、金標復溶液（廣州萬聯生物科技有限公司）；氯金酸、檸檬酸三鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；羊抗鼠IgG（北京全式金生物有限公司）；河豚毒素標準品（成都曼斯特生物科技有限公司）；河豚毒素包被原、抗河豚毒素單克隆抗體，均為實驗室自制；其余試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

HGS510 劃膜儀、HGS201 裁條機、GIC-Q 金標讀數儀（杭州峰航科技有限公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；MS旋渦振蕩器（德國IKA 公司）；SKFG-01烘箱（湖北黃石市恒豐醫療機械有限公司）；Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠體金的制備與鑒定

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒［37］。稱量100.0 mL一級水于干凈的圓底燒瓶中，置于磁力攪拌油浴鍋中（180 ℃，700 r/min）攪拌加熱回流至煮沸，加入4.0 mL 10.0 g/L的氯金酸溶液，持續加熱攪拌至再次沸騰，迅速加入4.6 mL 10.0 g/L 的檸檬酸三鈉溶液，持續攪拌至溶液顏色變成透亮的酒紅色，再攪拌10 min停止加熱，繼續攪拌5 min，冷卻至室溫，于4 ℃保存備用。

通過紫外掃描對膠體金進行表征：對制備的膠體金溶液進行紫外-可見分光光度計全光譜掃描，獲得膠體金溶液在可見光區（400～650 nm）的吸收光譜，記錄其最大吸收峰的波長，并根據線性方程Y=0.786X+505.53計算膠體金的粒徑大小，其中Y為最大吸收波長（nm），X為膠體金粒徑大小（nm）［38］。

1.3.2 單克隆抗體-膠體金標記物的制備

取1 mL 制備好的膠體金溶液于離心管中，加入適量0.1 mol/L K2CO3溶液并振蕩混勻，使體系pH值達到蛋白質等電點以確?？贵w與納米金顆粒形成牢固化合物［39］。隨后向離心管中加入定量抗體室溫孵育5 min 后，加入10 μL 100.0 g/L 牛血清白蛋白溶液（BSA）封閉未結合位點，室溫下孵育20 min。最后在4 ℃條件下12 000 r/min 離心15 min，棄上清，加入1.0 mL 金標復溶液使紅色沉淀物復溶并混勻，將其包被在96孔酶標板中，包被體積為15 μL，45 ℃過夜烘干，待用。

1.3.3 膠體金免疫層析法的建立

1.3.3.1 試紙條的制備及組裝 免疫層析試紙條分別由4部分組成，將吸水墊、硝酸纖維素膜以及樣品墊按照從上至下的順序依次交疊粘貼于聚氯乙烯底板上。硝酸纖維素膜上利用劃膜儀分別噴涂用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4）稀釋至適合濃度的抗原和羊抗鼠IgG 作為檢測線（T 線）和質控線（C 線），45 ℃干燥箱中靜置過夜，待用。另外將玻璃纖維素膜（預先切割成22 mm 寬）在樣品墊處理液中浸泡10 min，取出后于45 ℃下過夜烘干，待用。

1.3.3.2 檢測步驟及原理 取100.0 μL 標準溶液或樣品提取液加入提前制備好的金標微孔中充分混勻，反應3 min 后，將微孔內的所有溶液吸出，滴加至試紙條的樣品墊上反應5 min。將含有待測物的溶液滴加在樣品墊上作為流動相，溶液在毛細管作用下沿著吸水紙方向移動。當樣品中無待測物質時，金標抗體與硝酸纖維素膜上固定化的抗原發生特異性結合，檢測T 線因標記物積累而顯色。當樣品中含有待測物質時，其與T 線上的抗原競爭結合抗體，從而使T 線顯色減弱或不顯色。無論樣品中是否含有待測物質，C線上噴涂的羊抗鼠IgG都會與金標抗體結合進行顯色，若不顯色則證明試紙條無效。

1.3.4 膠體金免疫層析法檢測條件的優化

為達到最佳的試紙條檢測靈敏度、穩定性以及色彩強度，研究并優化了膠體金體系的pH值、抗原抗體用量、離子濃度、表面活性劑種類以及樣品前處理方法等影響膠體金層析卡性能的條件。為篩選最佳條件，利用膠體金讀數儀對試紙條進行掃描，得到T 線和C 線的信號值。抑制率按公式：抑制率（%）=（B0-BX）/BX×100計算，其中，BX為陽性樣品T線和C 線信號強度比值，B0為陰性樣品T線和C 線信號強度比值。

1.3.5 試紙條的性能評價

1.3.5.1 靈敏度 膠體金免疫層析法不僅可以對目標分析物進行定性檢測，還可以利用膠體金讀取儀進行定量檢測。定性檢測時，裸眼消線值（Cut-off）為定性檢出限，即引起T 線顏色消失的最低分析物濃度。在上述優化條件下，使用0.01 mol/L 磷酸緩沖溶液配制系列標準品溶液（0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 ng/mL），定量分析時，用讀數儀讀取各試紙條的T 與C 值，以檢測樣本與陰性樣本檢測線信號值的比值（B/B0）為縱坐標，河豚毒素濃度的對數值為橫坐標繪制散點圖，用Origin S 型曲線擬合后得標準曲線和線性方程。根據線性方程可計算出半抑制濃度IC50（B/B0=0.5時的藥物濃度）用于評估試紙條靈敏度和檢出限IC10（B/B0=0.9時的藥物濃度），同時通過相關數（r2）判斷線性方程的擬合度。

1.3.5.2 實際樣品檢測 樣品前處理：選取2 g 勻漿后的陰性樣本于50 mL 離心管中，加入2 mL 提取劑，渦旋振蕩2 min后于4 000 r/min離心10 min，吸取100 μL上清液稀釋數倍后即得到提取液。為保證樣品提取效率并簡化前處理流程，消除基質效應，對提取劑種類、提取液稀釋倍數進行優化。

選擇河豚、織紋螺兩種陰性樣品進行河豚毒素加標回收實驗。向樣本中添加河豚毒素使其最終含量為44、70、100 ng/g，在優化的前處理方法下進行提取，每一含量設置3個平行，計算回收率及相對標準偏差（RSD）。

2 結果與討論

2.1 膠體金的表征

膠體金免疫層析分析方法（GICA）檢測信號的大小與膠體金顆粒大小有關，直徑在20 nm 以下會出現顯色過淺的現象，但粒徑過大則會產生空間位阻效應。膠體金免疫層析法常用的粒徑大小為20～40 nm［35］，該區間的金粒子顯橙紅色且穩定性強。由圖2A 可知，制備的膠體金的最大吸收波長為531 nm，此時吸光度值為OD531=1.6 486。根據“1.3.1部分”公式計算，可得到膠體金的粒徑大小約32 nm。電鏡圖（圖2B）顯示，膠體金顆粒分布均勻。

圖2 膠體金溶液鑒定結果Fig.2 Identification result of colloidal gold

2.2 膠體金免疫層析條件優化

2.2.1 標記pH值及抗體濃度的優化

膠體金顆粒對蛋白質的吸附程度主要取決于溶液的pH值，在接近蛋白質等電點或偏堿條件下，二者容易形成牢固的結合物［36］。若pH值偏低會破壞膠體金表面的靜電荷，導致膠體金自身共聚，發生變色，靜置后產生肉眼可見的顆粒性沉淀；而pH值偏高時，金粒子與抗體間的作用力不足，吸附蛋白量少，制得的試紙條的檢測顯色明顯減弱，靈敏度顯著降低［37］。膠體金體系pH值一般通過控制標記過程中K2CO3溶液的體積來調節。本文采用0.1 mol/L K2CO3溶液對體系pH值進行優化。將1 mL膠體金溶液加入到經超純水潤洗后的1.5 mL 離心管中，向其中分別加入不同體積的0.1 mol/L K2CO3，其余操作步驟同“1.3.2”。相同參數條件下，向陰性試紙條中加入100 μL不含待測物的磷酸緩沖液，向陽性試紙條中加入100 μL 5 ng/mL 河豚毒素，進行兩組平行實驗。結果顯示，當K2CO3溶液體積從8 μL 增加到20 μL 時，試紙條的T、C 線顏色明顯加深，繼續增加K2CO3溶液體積，試紙條T、C 線的顏色變淺，K2CO3溶液體積為20 μL 時試紙條的抑制率最高（圖3A），且T、C 線顏色最深。因此K2CO3溶液體積為20 μL時，該試紙條靈敏度最高，顯色情況最好。

圖3 不同反應條件對GICA性能的影響Fig.3 Effects of different reaction conditions on GICA performance

標記抗體用量是影響試紙條性能的重要因素。當標記抗體量過多時，會出現游離抗體與已結合抗體共同競爭待測物質，導致試紙條出現假陰性；還會出現檢測線顏色過深且拖尾，造成抗體浪費。當標記抗體量過少時，則膠體金標記不完全，導致試紙條T、C線顏色過淺造成誤判。因此在上述最優的K2CO3溶液加入量基礎上，分別添加不同體積抗體進行優化，其中河豚毒素抗體的質量濃度為7.8 mg/mL。結果顯示，在最適pH 值下，隨著標記的抗體濃度逐漸升高，試紙條陰性T 線顯色逐漸增強，當標記抗體為5、6 μL 時，試紙條顏色滿足后續檢測要求，且抗體為5 μL 時具有更高的抑制率（圖3B）；抗體添加量為7 μL時雖然抑制率高，但顯色與5 μL時相差不大。故確定5 μL為最優的抗體標記體積。

2.2.2 T線與C線包被濃度優化

在達到最佳pH 值和抗體標記體積條件后，為使試紙條獲得最佳顯色效果，需對T線和C 線的濃度進行優化。包被在NC膜上的T線抗原濃度會影響其與抗體的反應，進而影響試紙條顯色強弱。抗原濃度高會加深T 線顯色導致靈敏度下降，反之抗原濃度低時T 線顯色較弱，造成實驗結果誤判且難以通過肉眼進行定性檢測。結果顯示，隨著抗原濃度升高，T 線顏色逐漸變深，當T 線質量濃度為0.2 mg/mL時，繼續增加抗原用量T線顏色無明顯變化且靈敏度降低（圖3C），說明結合趨于飽和，故選擇靈敏度最高的0.1 mg/mL為最佳T線包被濃度。

以C 線噴涂羊抗鼠IgG 作為質量控制線，根據其顯色情況可判斷試紙條是否有效，因此在最佳抗原濃度下，需對C線包被濃度進行優化。結果顯示，隨著二抗濃度的增加，試紙條C線顏色逐漸變深，但抑制率逐漸下降，當包被質量濃度為0.05 mg/mL 時，顯色過淺且T/C 值過高（圖3D）；包被質量濃度為0.2 mg/mL時，T/C值在1.0～1.5之間，C線顯色度適中且靈敏度較好。故選擇0.2 mg/mL為最佳C線包被濃度。

2.2.3 稀釋液種類與離子濃度的優化

稀釋液對標品待測液具有良好的緩沖效果，同時還具有很好的鹽平衡能力。緩沖溶液中不同的離子種類會對試紙條性能及抗原抗體結合效率產生一定影響。選擇常見緩沖劑為藥物稀釋液進行優化。結果顯示，稀釋液為磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（CAB）時，抑制率高，但顯色過淺，不適用于后續檢測；硼酸緩沖溶液（BB）作為稀釋液時，試紙條T 線不顯色且抑制率過低（圖4A）。而磷酸緩沖溶液（PB）則表現出良好的顯色效果和靈敏度，故選擇PB為最佳稀釋液。

圖4 稀釋液種類（A）及其離子濃度（B）對GICA性能的影響Fig.4 Effects of diluent type（A） and its concentration（B） on the GICA performance

稀釋液離子濃度也會影響抗原抗體反應活性及藥物與抗體的反應效率。結果顯示，隨著稀釋液離子濃度的降低，試紙條顯色無明顯變化，陰性T/C 值及抑制率均不斷升高，且在PB 緩沖液離子濃度為0.0 125 mol/L 時抑制率達到最高（圖4B）。但由于緩沖液中離子濃度過低時緩沖效果欠佳，達不到良好的基質消除效果，不適用于后續的樣品處理。故選擇0.1～0.025 mol/L 的PB 緩沖液稀釋液用于后續實驗。

2.2.4 樣品墊緩沖液種類與蔗糖濃度及表面活性劑濃度優化

樣品墊的緩沖體系不僅影響抗原抗體在NC膜上的結合，還對待測液起到一定的緩沖作用，因此探究了PB、PBS、BB、Tris-HCl等幾種常用溶液作為樣品墊緩沖液對試紙條檢測性能的影響。圖5A結果顯示，當PB 為緩沖液時，抗原抗體的結合受到較大影響，試紙條顯色不明顯。緩沖液為PBS、BB、Tris-HCl 時，試紙條顯色強度明顯提升，且PBS 抑制率最高，顯色明顯。因此，選擇PBS 為樣品墊緩沖液。

圖5 樣品墊不同配方對GICA性能的影響Fig.5 Effects of different formulations of sample pads on the GICA performance

一定含量的小分子物質如蔗糖、海藻糖、甘油等有利于膠體金溶液的穩定性，通過向樣品墊處理液中加入不同含量的蔗糖考察其對試紙條性能的影響。結果表明，在同一檢測條件下，不添加蔗糖顯色很淡，隨著蔗糖含量的增大，試紙條顯色逐漸加深，抑制率也逐漸升高，當蔗糖含量達1%后，進一步增加其含量試紙條顏色無變化（圖5B），故選擇樣品墊中最優蔗糖含量為1%。

大分子物質作為膠體金探針的骨架，可起到穩定體系的作用，因此對樣品墊上的表面活性劑含量進行優化。當向樣品墊處理液中添加不同含量的聚乙烯基吡咯烷酮（PVP-40）時，試紙條顯色強度及靈敏度均明顯下降，且樣品墊中添加表面活性劑時，T、C線均顯色較淺（圖5C）。故選擇樣品墊中不添加表面活性劑。

2.3 樣品前處理優化

在實際樣品檢測中，基質效應會極大影響結果的準確性，導致實際回收率結果不理想。因此對樣品的前處理方法進行優化，以提高回收率、縮短前處理時間，實現快速檢測。河豚、織紋螺兩種陰性樣本經攪碎勻漿后，以3 種提取劑進行提取，通過稀釋不同倍數消除樣品基質效應及提取試劑對體系的影響，建立該條件下的樣品標準曲線，并通過與緩沖液體系下的標準曲線進行對比，確定最佳前處理方法，以獲得更高的靈敏度及準確度。

2.3.1 提取溶劑優化

基于河豚毒素微溶于水，易溶于稀酸的特性，對比了0.1 mol/L PB 緩沖液、3%對甲苯磺酸（TsOH）和1%乙酸（HAc）3種提取劑的效果。結果顯示，乙酸提取時T、C線顯色均不明顯，因此乙酸不適用于樣品的提取。使用對甲苯磺酸提取時得到的標準曲線與PBS所得曲線的形狀及IC50值最為接近（圖6A）。因此，最終選取對甲苯磺酸作為提取溶劑。

圖6 前處理方式對GICA性能的影響Fig.6 Effect of pretreatment method on GICA performance

2.3.2 稀釋倍數優化

對TsOH的稀釋倍數進行優化。圖6B結果顯示，隨著稀釋倍數從10倍提高到20倍，所得到的標準曲線的IC50越來越接近稀釋液的IC50，即可減少基質效應影響并提高最終回收率。故最終確定稀釋倍數為20倍。

2.4 試紙條性能評價

2.4.1 靈敏度

在上述優化條件下進行實驗，以TTX 的質量濃度和試紙條檢測結果繪制標準曲線。當 TTX 為12.0 ng/mL 時，膠體金試紙條檢測線條帶完全消失，因此該試紙條檢測TTX 的裸眼消線值為12.0 ng/mL。通過結果擬合，本研究所建立方法的檢出限為0.5 ng/mL，IC50為 3.2 ng/mL（圖7A）。在0.8～10.6 ng/mL TTX 質量濃度范圍內，所建立的GICA 方法對 TTX 檢測具有良好的線性關系，線性回歸方程為Y=0.69-0.47X（r2=0.998）（圖7B），式中Y為檢測樣本與陰性樣本檢測線信號值的比值（B/B0），X為河豚毒素質量濃度的對數值。

圖7 GICA性能評價Fig.7 Performance evaluation of the GICA

2.4.2 實際樣品檢測

選擇河豚、織紋螺兩種陰性樣品進行加標回收實驗。河豚毒素的加標水平分別為44、70、100 ng/g，每個水平設3個平行。在優化的前處理條件下，所得結果如表1所示，樣品的加標回收率為70.5%～110%，RSD 為3.7%～7.1%，檢測結果與LC-MS/MS 法一致（圖7C）。與文獻中河豚毒素的檢測方法進行對比（表2），結果表明本研究建立的免疫層析法不僅靈敏度高，且操作簡便、成本低，能滿足市場的大批量篩查需求。

表1 樣品加標回收檢測結果（n=3）Table 1 Recoveries of spiked samples（n=3）

表2 河豚毒素檢測方法對比Table 2 Comparison of the analytical methods for TTX

2.4.3 試紙條穩定性

在50 ℃ 下進行加速穩定性實驗，利用高溫環境模擬驗證試紙條的穩定性，不同時間后試紙條的性能變化如圖7D所示。結果表明，加速實驗7、14、28天后，試紙條的各項性能均保持良好穩定性。

3 結 論

本研究基于實驗室自制的河豚毒素單克隆抗體構建了膠體金免疫層析檢測方法，實現了河豚毒素的快速定量檢測。方法檢出限為0.5 ng/mL，IC50為3.2 ng/mL，線性范圍為0.8 ～10.6 ng/mL。河豚和織紋螺樣品的加標回收率分別為75.0%～90.5%和70.5%～110%。本研究建立的免疫分析方法適用于水產品中河豚毒素的現場快速篩查，可作為風險監測和預警手段用于實際監管。