多波長自動融合指紋圖譜策略及其在蜂膠質量評價中的應用

姜慧潔，章 越，慎凱峰，姜 艷，周丹英，趙洪靜

（1. 浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023；2. 國家市場監督管理總局食品審評中心，北京 100070）

蜂膠收載于2020 年版《中國藥典》，為蜜蜂科昆蟲意大利蜂（Apis melliferaL.）工蜂釆集的植物樹脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合而成的固體膠狀物，蜂膠乙醇提取物是用乙醇浸提蜂膠得到的物質［1-2］。蜂膠中大量的黃酮和多酚類物質與其生理活性密切相關，建立蜂膠中黃酮和多酚類物質的指紋圖譜方法是提高蜂膠質量評價的重要手段［3-4］。研究蜂膠指紋圖譜的文獻大多采用270、280、310 nm或者其他單一波長作為檢測波長。由于黃酮、多酚等物質的紫外吸收不一致，導致單波長指紋圖譜所包含的信息量不夠全面，不同指紋圖譜間的差異不明顯，相似度評價或化學模式識別不顯著［5-9］。

目前多波長融合技術是豐富指紋圖譜信息的一種重要手段，只有合理整合各波長下各色譜峰的吸收信息，結合統計學辨識關鍵信息，才能準確表征待測樣品的全組分質量［10-12］。有的多波長融合技術為切波長技術，即根據化學成分的不同保留時間選擇不同的檢測波長［13-15］。該方法增加了多組分下色譜峰的信息，但對方法保留時間的耐用性要求較高。有的多波長融合技術經過權重法、均值法和投影參數法等數學方法整合各波長的信息，然后進行綜合的差異評價［16-17］。有的多波長融合技術通過多個波長的數據處理，融合成一個新的指紋圖譜，再進行差異評價。如許平翠、于洋等［18-19］在不同波長色譜圖上選擇指紋峰信號最大且峰數最多的區段，采用Matlab軟件進行等基線波長融合。Zhang等［20］介紹的多波長指紋圖譜融合方案為設定主波長與次波長，若某個次波長的色譜峰峰面積大于主波長的，則次波長的色譜峰峰面積信息替換主波長的，形成新的峰面積棒狀色譜圖。該多波長融合的數據需人工處理，若指紋圖譜的色譜峰、檢測波長及樣品批次多，則數據處理過程較費時。Yang、Yan、馬迪迪等［21-23］提出的多波長指紋圖譜融合方案需使用“中藥指紋超級信息特征數字化評價系統”軟件構建一個新的指紋圖譜，該軟件屬于具有專利的收費軟件，其他科研人員無法直接使用。上述文獻中對于多波長數據的融合處理較為繁瑣或需要特殊軟件，不利于融合指紋圖譜的推廣應用。

本研究提出了一種可以簡化數據處理過程的多波長自動融合指紋圖譜策略，并以蜂膠乙醇提取物為研究對象進行質量評價。通過超高效液相色譜（UPLC）技術采集蜂膠多個波長下的指紋圖譜信息，巧妙運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件，簡化了多波長數據融合的復雜處理過程，準確生成多波長融合指紋圖譜，并進一步通過相似度評價、主成分分析和聚類分析比較了不同廠家蜂膠的質量差異。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜儀（1260 Infinity II Prime LC，安捷倫公司）；十萬分之一電子天平（XS105DU，梅特勒公司）；萬分之一電子天平（ME204，梅特勒公司）；數控超聲波清洗器（KQ-500，昆山市超聲儀器有限公司）。

15批中國蜂膠乙醇提取物分別來源于杭州天廚蜜源保健品有限公司、浙江福賜德天然蜂產品有限公司、浙江蜂之語蜂業集團有限公司、浙江金童生物科技有限公司、浙江知元堂生物藥業有限公司，蜂膠原料均為楊樹屬，產地浙江（見表1）。蘆丁（批號100080-202012，純度92.2%，下同）、槲皮素（100081-201610，99.1%）、山奈素（110861-201611，95.5%）、芹菜素（111901-202004，99.4%）、異鼠李素（110860-201611，99.8%）、綠原酸（110753-202119，96.3%）、阿魏酸（110773-201915，99.4%）、異阿魏酸（111698-201904，99.3%），購于中國食品藥品檢定研究院；楊梅素（PS001011，98.0%）、咖啡酸（PU1191-0025，98.0%）、ρ-香豆酸（PS1415-0100，98.0%）、3，4-二甲氧基肉桂酸（PS2514-1000，98.0%）、肉桂酸（PU0942-0050，98.9%）、咖啡酸苯乙酯（PS1444-0050，98.0%），購于成都普思生物科技股份有限公司；喬松素（MUST-17022604，純度99.52%）、白楊素（MUST-17040901，99.57%）、高良姜素（MUST-17020912，98.73%）、異綠原酸A（MUST-22110413，98.46%）、異綠原酸C（MUST-22081001，99.77%），購于成都曼思特生物有限公司。阿替匹林C（A26GB159041，97.0%），購于上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純，美國TEDIA）；甲醇、磷酸（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

表1 蜂膠樣品信息Table 1 Sample information of propolis

1.2 多波長自動融合指紋圖譜策略

多波長自動融合指紋圖譜策略的步驟包含：①UPLC分析方法的開發；②多批次樣品的多波長檢測與數據收集；③多波長數據的自動融合；④融合對照指紋圖譜的生成與相似度評價；⑤多波長融合數據的化學模式識別。其中步驟③基于均值法，即A=（a1+a2+……an）/n，式中A為融合指紋圖譜中某個峰的峰面積，a為單波長指紋圖譜中某個峰的峰面積，n為檢測波長數量。僅通過運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件即可完成多波長數據的融合處理，且處理過程基本不受指紋圖譜復雜程度的影響。

1.3 蜂膠多波長自動融合指紋圖譜的研究

1.3.1 蜂膠UPLC 指紋圖譜方法色譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent，Poroshell 120 EC-C18，3 mm×100 mm，2.7 μm）；以甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫：0～3 min，15%～25% A；3～13 min，25%～40% A；13～38 min，40%～48% A；38～45 min，48%～55% A；45～55 min，55%～75% A；55～60 min，75%～90% A；60～65 min，90%～15% A；流速為0.6 mL/min；柱溫為35 °C；檢測波長為220、245、270、320 nm。

供試品溶液的制備：取樣品0.25 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲處理30 min（功率250 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

對照品溶液的制備：取蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈素、芹菜素、異鼠李素、喬松素、白楊素、高良姜素、綠原酸、咖啡酸、ρ-香豆酸、阿魏酸、異阿魏酸、異綠原酸A、3，4-二甲氧基肉桂酸、異綠原酸C、肉桂酸、咖啡酸苯乙酯、阿替匹林C 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度依次為21.74、25.82、15.75、22.87、54.68、12.22、9.43、47.17、14.44、13.85、17.89、19.50、9.50、17.92、17.45、20.85、16.57、19.43、19.50、22.55 μg/mL的混合對照品溶液。

測定法：分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液3 μL，注入液相色譜儀，測定，對色譜圖進行積分處理，導出各樣品在220、245、270、320 nm波長處的AIA文件。

1.3.2 蜂膠多波長數據的自動融合方法依次將每個樣品在4個波長處的AIA文件導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012.130723 版本），參照圖譜為S1，對照圖譜生成方法為平均數，時間窗寬度為0.1，全峰匹配生成多波長融合指紋圖譜，并單獨導出XScp 文件。指紋圖譜軟件自動識別同一樣品不同波長下相同保留時間的色譜峰，多波長融合指紋圖譜中各色譜峰的保留時間即為原色譜峰的保留時間，各色譜峰的峰面積為多波長下峰面積加和的平均值，不同批次樣品的指紋圖譜在自動融合時均遵循相同的處理規則。

1.3.3 多批次蜂膠多波長融合指紋圖譜的生成將收集的15 批蜂膠樣品按照上述方法測定，依次生成多波長融合指紋圖譜。將生成的15 批蜂膠多波長融合指紋圖譜XScp 文件重新導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”，生成多波長融合對照指紋圖譜。其中生成的融合對照指紋圖譜的保留時間即為多個融合指紋圖譜各色譜峰的保留時間加和平均值，峰面積即為多個融合指紋圖譜各色譜峰的峰面積加和平均值。

1.4 單波長與多波長融合模式的對比

通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”、Excel軟件、SIMCA 13.0統計分析軟件，分別從共有色譜峰、相似度評價、主成分分析、聚類分析方面對蜂膠270 nm 波長指紋圖譜和多波長融合指紋圖譜進行對比。

2 結果與討論

2.1 蜂膠多波長融合指紋圖譜的研究

2.1.1 多波長的選擇依據根據文獻調研考察了20種黃酮與酚酸類對照品，根據色譜峰的定性研究，蜂膠指紋圖譜中可定性14個共有峰，故測定了14個代表性黃酮、酚酸類成分的紫外吸收曲線，各成分的最大吸收值見表2。若選擇的檢測波長數量過多或存在不合適的波長，則經過各個波長下同一個物質色譜峰的加和平均后，色譜峰的峰面積偏小，差異性反而下降。蜂膠預實驗的檢測波長為220、245、270、320、360 nm，但在數據處理時發現360 nm 下的成分較少，且此時，這些成分在320 nm 波長下均有體現，綜合考慮選擇220、245、270、320 nm這4個波長全面表征蜂膠成分信息。波段分布均勻且基本涵蓋了各成分的最大吸收值。

表2 各黃酮、酚酸類成分的最大紫外吸收情況Table 2 Maximum UV absorption of various flavonoids and phenolic acids

2.1.2 多波長融合指紋圖譜的生成單個蜂膠樣品的4個單波長指紋圖譜經過軟件自動融合形成1個多波長融合指紋圖譜（見圖1A）。相同方法處理后得到15批蜂膠樣品的多波長融合指紋圖譜（見圖1B）。

圖1 4個波長生成的融合指紋圖譜（A）以及15批蜂膠的多波長融合指紋圖譜（B）Fig. 1 Fusion fingerprint generated by wavelengths （A） and multi-wavelength fusion fingerprints of 15 batches of propolis （B）

2.1.3 多波長融合指紋圖譜的方法學考察由多波長融合對照指紋圖譜（圖2B）可以看出，8號峰峰面積大小適宜，分離效果較好，通過對照品對比定性為槲皮素，故選其作為參照峰用于計算相對保留時間與相對峰面積。取同一份蜂膠供試品溶液連續進樣5 次，進行精密度檢測。結果顯示融合共有色譜峰的相對保留時間的RSD 為0.02%～0.16%，相對峰面積的RSD 為0.56%～3.85%，表明液相檢測方法與融合圖譜生成方法的精密度較好。取同一份蜂膠供試品溶液，在0、4、8、12、24 h 進行穩定性檢測。經計算融合共有色譜峰的相對保留時間的RSD 為0.04%～0.15%，相對峰面積的RSD 的為0.97%～4.67%，方法的穩定性較好。取同一份蜂膠樣品，按照供試品溶液制備方法分別制備5份，依次進行檢測，結果顯示融合共有色譜峰的相對保留時間的RSD 為0.01%～0.13%，相對峰面積的RSD 為1.02%～4.39%，方法的重復性良好。

圖2 單波長對照指紋圖譜（A）、多波長融合對照指紋圖譜（B）與對照品色譜圖（C）Fig. 2 Single wavelength reference fingerprint（A），multi-wavelength fusion reference fingerprint（B），and reference chromatogram（C）

2.2 單波長指紋圖譜與多波長融合指紋圖譜的對比

2.2.1 對比波長的選擇以蜂膠270 nm 單波長指紋圖譜與多波長融合指紋圖譜進行對比，主要原因如下：2005 版《中國藥典》中蜂膠的含量測定為白楊素（268 nm）、高良姜素（268 nm）［24］，2020版《中國藥典》為白楊素（270 nm）、高良姜素（270 nm），增加了喬松素（289 nm）、咖啡酸苯乙酯（329 nm）含量的測定［1］。行業標準中蜂膠多種成分含量測定或指紋圖譜的波長為280、360 nm［25-27］。知網文獻中蜂膠多種成分含量測定或指紋圖譜的波長為270、280、290、310 nm［5-9］。即黃酮成分的檢測波長傾向270、280 nm，酚酸成分的檢測波長傾向310、360 nm。表明前期蜂膠成分研究更側重于黃酮成分，且270 nm 檢測波長下蜂膠指紋圖譜的色譜峰信息較為全面，可作為與多波長融合指紋圖譜分析的對比圖譜。

2.2.2 共有色譜峰的對比蜂膠270 nm 單波長指紋圖譜研究中，15批樣品有33個共有色譜峰，其中峰面積大于500 的色譜峰19 個，大于400 的25 個，大于300 的29 個，大于200 的32個，選擇峰面積大于200 的32 個色譜峰為特征峰。蜂膠270 nm 單波長對照指紋圖譜含有32 個特征峰（表3），其中12 個特征峰可定性（見圖2A），特征峰的信息見表3。由表3 可知，特征峰保留時間的RSD 均小于1.00%，峰面積的RSD 為14.33%～113.62%，平均值為35.24%。

表3 蜂膠單波長對照指紋圖譜（270 nm）的特征峰信息Table 3 Characteristic peak information of propolis single wavelength reference fingerprint （270 nm）

蜂膠多波長融合指紋圖譜研究中，15批樣品共有的色譜峰有44個，其中峰面積大于500的色譜峰22個，大于400的26個，大于300的27個，大于200的33個，選擇峰面積大于200的33個色譜峰為特征峰。這些特征峰中有14 個可定性（見圖2B、2C）。相比于270 nm 單波長，可定性的特征峰中增加了咖啡酸和阿魏酸特征峰。蜂膠多波長融合對照指紋圖譜的特征峰信息見表4，特征峰保留時間的RSD均小于1.00%，保留時間的差異較小，即建立的蜂膠融合指紋圖譜作為質量控制方法具有科學性。特征峰峰面積的RSD 為14.39%～112.02%，平均值為37.94%，峰面積之間差異較大，說明不同廠家蜂膠之間的黃酮、酚酸等成分種類較相似，但含量存在差異。

表4 蜂膠多波長融合對照指紋圖譜的特征峰信息Table 4 Characteristic peak information of propolis multi-wavelength fusion reference fingerprint

2.2.3 相似度評價的對比對15批蜂膠的270 nm 單波長指紋圖譜和多波長融合指紋圖譜分別進行相似度分析，結果見表5。15 批樣品單波長指紋圖譜的相似度較高，為0.928～0.997，其中S14、S15 的相似度相對較低。各融合指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.902～0.994，與單波長相比，多個樣品的相似度均明顯下降，說明多波長融合指紋圖譜更能全面分析各批次之間的差異性。但各批次的相似度仍然較高，表明不同批次的蜂膠乙醇提取物表現出了良好的相似度，即浙江不同廠家產品的整體質量較為穩定，所含成分種類較為一致。

表5 蜂膠指紋圖譜的相似度評價結果Table 5 Similarity evaluation results of propolis fingerprint

2.2.4 主成分分析的對比以15批蜂膠270 nm單波長指紋圖譜中32個特征峰的峰面積為變量，輸入SIMCA 13.0 統計分析軟件進行模型分析，將主成分數量設置為3 時，模型的R2X=0.901，Q2=0.757，即前3個成分的累積貢獻率達90.1%，模型擬合良好。進一步進行主成分分析（PCA），可將所峰膠樣品分為3 類（圖3A），一類是S4～S10，即廠家2 和廠家3；一類是S11～S13，即廠家4；一類是S1～S3 和S14～S15，即廠家1 和廠家5。同一類樣品的特征峰峰面積大小較接近。同一廠家不同批次的樣品基本穩定，聚為一類；廠家2和廠家3的樣品較一致，無法區分。

圖3 單波長（A）與多波長（B）蜂膠指紋圖譜的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of single wavelength（A） and multi-wavelength（B） propolis fingerprint

（續表3）

以15批蜂膠融合指紋圖譜中33個特征峰的峰面積為變量進行模型分析，主成分數量設置為3，模型的R2X=0.923，Q2=0.790，前3 個成分的累積貢獻率達92.3%，模型擬合良好。主成分分析結果見圖3B，樣品可被分為4 類，一類是S4～S10，即廠家2 和廠家3；一類是S11～S13，即廠家4；一類是S1～S3，即廠家1；一類是S14～S15，即廠家5。相比單波長的主成分分析更有區別性，能將廠家1和廠家5的樣品進行區分。

其中270 nm 單波長主成分1 中各色譜峰的載荷情況見圖4A。峰5、7、9、10、11、12、17、18、21、23、24、25 的值大于0.2，對主成分1的貢獻較大。多波長融合主成分1中各色譜峰的載荷情況見圖4B。峰1、7、10、11、13、19、21、24、28 的值大于0.2，對主成分1 的貢獻較大。同蜂膠270 nm單波長圖譜的分析結果相比，蜂膠融合指紋圖譜中0～20 min 保留時間的色譜峰加強，增加了酚酸類成分的特征峰，如咖啡酸、阿魏酸，并且平衡了某些峰面積較大成分對差異性評價的影響（如白楊素）。

圖4 單波長（A）與多波長（B）主成分1中各色譜峰的載荷圖Fig.4 Load graph of each chromatographic peak in single wavelength（A） and multi-wavelength（B） principal component 1

2.2.5 聚類分析的對比在3 個主成分的基礎上，采用Ward 法計算距離，以平方歐氏距離為分類依據，進行聚類分析（HCA），繪制15 批蜂膠270 nm 單波長指紋圖譜的聚類分析圖，見圖5A。當距離為50時，可將樣品分為3類，一類是S4～S10、一類是S11～S13、一類是S1～S3和S14～S15，同主成分分析的結果吻合。

圖5 單波長（A）與多波長（B）蜂膠指紋圖譜的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of single wavelength（A） and multi-wavelength（B） propolis fingerprint

采用同樣方法與參數繪制15批蜂膠融合指紋圖譜的聚類分析圖，見圖5B。當距離為100時，可將樣品分為3 類，分類結果與單波長指紋圖譜分類結果一致。當距離為50 時，可將樣品分為4 類。一類是S4～S10，即廠家2、廠家3；一類是S11～S13，即廠家4；一類是S1～S3，即廠家1；一類是S14～S15，即廠家5，同主成分分析的結果基本吻合。當距離繼續減小時，S4～S10 也能進行劃分，除批次S6，其他均能正確分類。表明在主成分分析、聚類分析處理上，多波長融合指紋圖譜的分類更加準確，提高了對色譜指紋圖譜差異性的評價能力。

3 結 論

本研究簡化了多波長融合指紋圖譜數據的自動融合處理過程，拓展了開源軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”的功能，可對多波長數據進行快速、自動融合處理，減少了人工對繁瑣數據的匯總、篩選、對應、加和與圖像生成等處理。多個單波長的指紋圖譜在遵循同一處理規則下自動融合生成一個新的多波長融合指紋圖譜，每個色譜峰即為不同波長下同一保留時間色譜峰的加和平均值。該數據融合處理策略雖屬于低級數據融合技術，但簡單快速，最大化地準確保留了各色譜峰的信息，利于融合指紋圖譜的應用與普及。建立的蜂膠多波長融合對照指紋圖譜含有33個特征峰，其中14個特征峰可定性，7 個為黃酮成分，7 個為酚酸成分，15 批蜂膠融合指紋圖譜的相似度為0.902～0.994，主成分分析、聚類分析可將樣品分為4 類。將多波長自動融合指紋圖譜策略應用于蜂膠質量評價中，可豐富黃酮、酚酸類物質在不同波長下的色譜信息，降低高峰面積成分對整體評價的影響，提高指紋圖譜差異評價的準確性，為蜂膠質量控制提供參考與借鑒。但本研究中，蜂膠乙醇提取物樣品的收集范圍較小，樣品均來源于浙江廠家，所建立的多波長融合指紋圖譜僅適用于不同廠家蜂膠提取物的區分。后續將進一步對不同省份、不同季節、不同提取工藝、不同種屬的蜂膠進行深入分析，提高多波長融合指紋圖譜在蜂膠質量評價中的應用范圍。