基于熒光光度法的水中石油類污染物便攜原位測定裝置研制與應用

巫培山，陳宇萍，2，梁維新*，郭鵬然，雷永乾，潘佳釧

（1.廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學測量與應急檢測技術重點實驗室，廣東廣州 510070；2.五邑大學 生物科技與大健康學院，廣東 江門 529000）

石油類污染物質在我國危險廢棄物名錄48 種危險物質中排名第8 位［1］，具有持久性、難降解、易積累的特點［2］，其含有的多環芳烴（PAH）如苯并［a］蒽、?、苯并［b］熒蒽具有潛在致癌性［3］，可干擾生物的生理功能，影響繁殖、生長和免疫能力，甚至導致生物死亡［4］。同時，石油類物質進入水體后可形成油膜阻礙水體的復氧作用，抑制生物呼吸和影響海洋浮游生物生長，破壞水生態環境平衡，造成嚴重的生態危害［5］。

目前石油類污染物質的測定方法主要有重量法［6］、氣相色譜法［7］、紅外分光光度法［8］、紫外分光光度法［9］和熒光分光光度法［10-11］等。其中熒光分光光度法利用石油類污染物中的芳烴組分在紫外光的激發下發射出特定波長的熒光特性進行測定，具有靈敏度高、響應快速、免破壞樣品等優勢［12］，但上述方法均為實驗室檢測方法，需從現場采集樣品，再通過有機溶劑萃取后測定，因此時間和人力成本較高，且需使用大量有機溶劑，難以實現現場原位、高頻率監測及全天候監測，無法及時反映水體真實污染狀況。水中石油類污染物的原位、快速分析技術具有實時性強、響應速度快的特點，可通過較高的頻率對目標水體進行現場原位監測，實現水中石油類污染數據的實時、連續數據反饋［13］以及監測數據自動化采集和傳輸，提高水環境智能化監測水平。該方法避免了頻繁人工采樣和樣品處理［14］，降低了整體監測成本，同時減少了人為因素對監測結果的影響，提高數據的可靠性［15］。國外對于水中石油類污染物的原位檢測技術起步較早，目前已有較成熟的技術與產品，市占率較高，如HACH 公司的FP360 sc、Turner designs 公司的C3TM等，而國內的同類型儀器起步相對較晚，為此，有必要開展水中石油類污染物的原位快速分析技術研究，為我國水生態環境監測提供技術支持。

本文研制了一種基于熒光光度法的水中石油類污染物原位測定裝置，考察了裝置檢測性能，并對實際樣品進行檢測。該研發裝置具有穩定性好、準確度高、響應速度快的優勢，適用于野外環境現場監測、環境事故現場應急檢測等領域。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

三維熒光光譜儀（Aqualog?，法國HORIBA Scientific 公司）；原位測油裝置（自研）；分析天平（BSA224S-CW，德國賽多利斯公司）。海洋環境監測石油成分分析標準物（以下簡稱HJ 油標準）（1 000 mg/L，國家海洋環境監測中心）；福爾馬肼渾濁度溶液標準物質（4 000 NTU，北京北方偉業計量技術研究院有限公司）；腐殖酸（≥90%）、正己烷（色譜純），購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；實驗用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）；汽油、柴油、重油、潤滑油等石油類標準物質由油品檢測服務機構提供。

1.2 標準溶液配制

石油類標準溶液：使用天平分別準確稱量0.01 g 的重油、柴油、汽油、潤滑油于燒杯中，加入正己烷溶解后轉移至25 mL 容量瓶，使用正己烷定容至刻度，得到各石油類污染物的標準儲備溶液。使用正己烷將石油類污染物標準儲備液稀釋至0.5、1、5、10、50、100、500、1 000 mg/L 后作為石油類標準溶液使用，使用三維熒光光譜儀測定。

水中油標準溶液：石油類污染物在水中溶解度較低，過量的油易在水體表面形成油膜，難以形成均勻的水中油溶液。本研究中，通過向高純水中加入一定量石油類物質，放置一段時間后去除表面油膜，將剩余溶液轉移至潔凈燒杯中以去除原容器中過量油在容器表面形成的油斑，所得即為均勻穩定的水中油標準溶液。使用正己烷萃取水中油標準溶液，然后采用實驗室測定方法測定萃取液中油類物質的濃度，最終得到水中油標準溶液中實際的油類濃度。本文采用常見的水中油類污染物重油、柴油以及潤滑油分別配制了3 種水中油標準溶液，其實際質量濃度分別為21.1、20.58、35.25 mg/L，并用于研制的原位測油裝置的校準和測試。

1.3 樣品測試方法

實驗室測試方法：參考文獻［11］，使用10 mL 正己烷萃取100 mL 水樣中石油類物質后使用三維熒光光譜儀測定其熒光強度，每次測定前潤洗比色皿2～3 次。原位測油裝置測試方法：無需采集水樣和采用有機溶劑進行萃取，根據測定深度將探頭浸入水下合適位置，穩定20 s后直接原位測定。

2 結果與討論

2.1 裝置原理與整體設計

石油類污染物中的芳香族化合物和多環化合物受到紫外光激發時，其分子內部的電子會躍遷到一個較高的能級，形成激發態，隨后，這些激發態的分子會發生非輻射躍遷返回到基態并釋放熒光，其熒光信號強度與濃度呈正相關［16］。因此，可以通過測量熒光強度計算水中石油類污染物的濃度，本工作即基于該原理研制水中石油類污染物的便攜式原位測試裝置。裝置整體采用浸入式探頭設計，主要由熒光光路以及數據采集兩部分組成，其中熒光光路部分由LED 激發光源、透鏡、二向色鏡、光電二極管組成，數據采集部分由精密光電轉換放大器、數模轉換器、下位機、上位機組成，系統的總體設計如圖1所示。

圖1 原位測油裝置整體設計圖Fig.1 Design of in-situ oil measurement device

上位機通過控制下位機驅動LED 激發光源發射紫外激發光，待測水樣中的石油類污染物在紫外光激發作用下產生熒光；熒光光路中的光電二極管檢測熒光強度并轉化為電流信號；精密光電轉換放大器接收并精確放大來自光電二極管的微弱電流信號，將其轉換為模擬電壓信號；模數轉換器將模擬電壓信號轉為數字信號并發送至下位機，再通過上位機轉化為濃度顯示。

2.2 激發波長與發射波長

使用三維熒光光譜儀測定了各類石油類物質（HJ油標準、重油、柴油、汽油、潤滑油）的三維熒光圖譜（見圖2）。實驗結果顯示，HJ油標準、汽油、柴油、潤滑油等的激發光波長主要在250～350 nm 范圍內，發射波長為300～450 nm；重質油的激發波長為250～400 nm，發射波長為300～500 nm；HJ 油標準的主要成分是20號柴油，屬于輕質油，因此其三維熒光圖與其他輕質油接近。重油和輕質油三維熒光圖譜的差異可能是由于石油分餾過程導致，重油和輕質油之間沸點的差異使重油含有更多的高沸點多環芳烴，而輕質油則含有更多的低沸點芳烴［17］。因此，確定石油類污染物的有效激發波長為250～400 nm，發射波長為300～500 nm。

圖2 HJ油標準（A）、重油（B）、柴油（C）、汽油（D）、潤滑油（E）及正己烷（F）的三維熒光圖譜Fig.2 Three-dimensional fluorescence spectra of HJ oil standard（A），heavy oil（B），diesel（C），gasoline（D），lubricating oil（E） and n-hexane（F）

2.3 激發光源

常用熒光激發光源包括脈沖氙燈光源、汞燈、激光器、LED 光源等，氙燈和汞燈可提供多個波段的高強度紫外激發光，目前已有商品化的微型脈沖氙燈和汞燈，但由于本裝置為水下浸入式探頭設計，內部空間緊湊，微型氙燈和汞燈的體積對于本裝置仍然較大而不適用。激光器光源亮度高、發光方向集中，但尚未發現具有合適波長的激光器。LED 光源具有較窄的譜線寬度，波長可選擇性較多，可提供相對純凈的激發波長，且結構緊湊，體積小巧，便于集成和安裝［18］，適合用于本裝置。

根據石油類污染物的熒光激發與發射波長的測定結果，選擇中心波長為254、275、305、365 nm的LED 光源，采用中心波長為360、450 nm 的帶通濾光片濾除激發光和環境光干擾，使用光電二極管測定熒光（與光源夾角90°，使用比色皿測定），考察不同激發光源與檢測波長的組合對石油類污染物的信噪比，結果如表1 所示。采用激發波長275 nm 與檢測波長360 nm 組合時裝置信噪比較好；采用365 nm 激發時，對HJ油標準的信噪比與254、305 nm 光源基本相當，對重油的信噪比高于二者。雖然365 nm 在各類油品中非最佳激發波長（見圖2），但該波長的LED 發光效率遠高于254～305 nm，由于檢測熒光強度與激發光強度成正比［19］，因此使用高光輻射功率的365 nm 激發光源獲得了與其他波長相當的信噪比；同時，由于能量轉換效率的差異導致254～305 nm 的LED 光源發熱和光衰較為嚴重，不適于長時間、高頻次的原位監測。綜合以上因素，最終選擇365 nm的LED作為激發光源。

表1 不同波長LED光源對石油類污染物檢測靈敏度的影響Table 1 Influence of different wavelength LED light sources on the sensitivity of petroleum pollutant detection

2.4 光路設計

圖3 為本研究研制的熒光光路原理圖，該光路利用二向色鏡對特定波長的選擇性透過和反射作用分離激發光與發射光，所采用的二向色鏡為具有透過特定波長（≤400 nm）的激發光，可反射待測樣品發射出的特定波長的熒光（≥400 nm）的光學特性。在激發光源開啟狀態時，激發光依次通過準直透鏡（平凸透鏡）、光源濾光片、二向色鏡后，再通過聚焦透鏡和光窗進入待測水樣中。待測水樣中的石油類污染物受到激發后，產生的熒光依次通過光窗和透鏡，通過二向色鏡反射作用，經過聚焦透鏡、發射濾光片后進入光電二極管中進行測定。該設計的優點是，激發與發射光均從同一個光窗進出，入射和出射角度相對一致，可以更容易進行對位調整，減少了對光路對齊的要求，簡化了系統結構，具有較好的光學系統穩定性和可靠性；同時，光窗垂直向下的設計可避免水體環境光的干擾。實驗發現當激發光的光斑約為2～3 mm時可獲得最大靈敏度。

圖3 原位測油裝置的熒光光路原理圖Fig.3 Schematic diagram of the fluorescence optical path of in-situ oil measurement device

2.5 數據采集模塊

在環境濃度下，石油類污染物產生的熒光強度非常微弱，如何精確放大光電二極管產生的微弱電流信號是保證裝置具有良好靈敏度和抗干擾能力的關鍵［19］。該器件通過I/V轉換電路、放大電路組成將微弱電流信號轉換為0～5 V 的電壓信號并輸出，采用低紋波線性電源對該器件供電，消除高頻噪聲干擾，確保輸出信號的準確性和穩定性。再通過AD 轉換器將電壓信號轉換為數字信號并發送至下位機中，完成數據的采集。

2.6 結構設計與集成

研制的石油類污染物的便攜式原位測定儀采用水下浸入式探頭設計，整體構造如圖4 所示，熒光光路模塊安裝于探頭底部，激發光與熒光均從安裝于底蓋處的光窗進出；底蓋、筒體外殼、頂蓋均使用316不銹鋼材料制成以應對海水、廢水等環境中的鹽離子、酸性物質和其他腐蝕性介質；I/V 轉換放大器與光電二極管采用短線材連接，以避免熒光產生的微弱電流信號受干擾；使用三層固定安裝支架分別安裝LED 驅動電源、下位機以及正負線性電源以保證器件散熱；外殼連接處均使用密封墊圈以及環氧樹脂密封連接以防止液體滲漏。

圖4 原位測油裝置結構Fig.4 Structure of in-situ oil measurement device

2.7 性能驗證

2.7.1 線性范圍按照“1.2”方法使用船舶油配制重油、柴油、潤滑油的水中油標準溶液，使用高純水逐級稀釋至一定倍數后，配制質量濃度分別為0、1、5、10、20 mg/L 的水中油溶液后，使用研制的原位測油裝置浸入水體中至完全沒入后，進行原位測定，實驗結果見表2。3 種石油類物質在0～20 mg/L質量濃度范圍時，線性結果良好。

2.7.2 干擾因素的考察為了考察原位測油裝置的測定干擾，使用原位測油裝置測定10 mg/L 水中油（重油）溶液，以及分別添加了腐殖酸和福爾馬肼溶液的水中油混合溶液。結果如圖5 所示，當溶液有機質（DOM）的質量濃度≤50 mg/L，濁度值≤10 NTU時，測定10 mg/L 水中油溶液的相對誤差在10%以內。由于環境水體中DOM的質量濃度一般≤20 mg/L［20-21］，濁度值主要集中在10 NTU范圍內［22］，因此實際環境水體在通常濃度下對本裝置的測定結果影響較小，基本滿足現場快速原位檢測的需求。

圖5 DOM質量濃度（A）及濁度（B）對測定10 mg/L水中油的影響Fig.5 Effects of DOM mass concentration（A） and turbidity（B） on detection of 10 mg/L oil in water solution

2.7.3 示值誤差與重復性使用原位測油裝置分別重復測定1 mg/L和10 mg/L的水中油標準溶液7次，根據公式：Δc=(-c-cs）/cs×100%計算裝置的示值誤差，式中Δc為示值誤差；-c為7次測量值的平均值（mg/L）；cs為標準溶液的質量濃度（mg/L）。以測定值的RSD評價裝置的重復性。測定結果如圖6所示，高濃度和低濃度的水中油溶液的示值誤差均在3%以內，表明準確性良好；在重復性方面，低濃度標準溶液的測定值的RSD雖然較高，但測定值基本在0.90～1.12 mg/L范圍內波動，滿足現場快速檢測的需求。

圖6 原位測油裝置在低濃度（A）與高濃度（B）水中油標準溶液的示值誤差與重復性Fig.6 Indication errors and repeatabilities of in-situ oil measurement device at low concentration（A）and high concentration（B） of oil in water

2.7.4 儀器比對測試配制一定濃度的水中油溶液a、b、c、d、e，分別使用原位測油裝置以及實驗室方法（使用正己烷萃取后通過三維熒光光譜儀測定）測定，對比兩種測試方法的結果（圖7A）。實驗結果顯示，使用實驗室儀器測定結果與原位測油裝置的測試結果非常接近，二者的差值基本在0.5 mg/L范圍內。通過線性回歸模型評價三維熒光儀與原位測油裝置測量值的相關性（圖7B），結果顯示二者的測量值具有很強的相關性，相關系數（R）為0.999 8，表明原位測油裝置與實驗室檢測方法之間具有良好的一致性。

圖7 原位測油裝置與實驗室測試方法的結果比對（A）及其相關性分析（B）Fig.7 Comparison of results measured by in-situ oil measurement device and laboratory measurement（A） and its correlation analysis（B）

2.7.5 檢出限以高純水作為空白樣品，使用原位測油裝置連續測定11 次，以11 次測定值的3 倍標準偏差與標準曲線斜率之比計算原位測油裝置對水中油的檢出限為0.42 mg/L，該結果滿足地表水環境質量標準（GB 3838-2002）IV和V類水質限值（0.5 mg/L和1 mg/L）的要求。

2.7.6 實際樣品測定分別取500 mL地下水、河流水、工廠廢水，使用實驗室檢測方法（見“1.3”）與原位測油裝置測定水中油的濃度。實驗結果見表3，原位測油裝置的測試結果顯示3種樣品的加標回收率為91.2%～114%，說明研制的原位測油裝置具有良好的準確性，可滿足環境水體的原位檢測需求。

表3 實際樣品的測定及加標回收率結果（n=3）Table 3 Determination of real sample and its recoveries（n=3）

3 結 論

本文研制了一種基于熒光光度法的水中石油類污染物便攜原位測定裝置，與現有測試方法與儀器對比，本裝置采用浸入式探頭原位測定水中油濃度，避免使用萃取劑，具有準確度高、靈敏度好、使用成本低、儀器便攜、環境友好等優勢，可應用于各類水體中石油類污染物的原位快速測定。