社區獲得性肺炎患兒肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測情況及特點分析

侯萍萍,黃小紅,溫志園

(梅州市人民醫院兒內科,廣東 梅州 514031)

社區獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)是指在醫院外罹患的肺實質炎癥,是兒科最常見疾病,也是5歲以下兒童最主要死因之一[1-2]。兒童CAP病原體種類繁多,臨床表現隱匿,加上兒童氣道阻力大、咳嗽反射弱,分泌物排出困難使得臨床治療較為困難[3]。早期明確病原學可及時給予針對性靶向抗感染治療,對提高兒童CAP治療效果非常關鍵。目前臨床病原體檢測主要有細菌培養及血清學試驗,但上述方法操作繁瑣,耗時較長,且檢測陽性率僅為30%～40%[4-5],敏感度和特異度均不高。因此,臨床亟需一種高效、敏感、準確、快速的病原學檢測方法。近年來,隨著分子診斷技術的發展,其在病原學檢測中得到廣泛應用。呼吸道病原體核酸十三項檢測即是利用分子診斷方法(生物芯片技術)對呼吸道常見的13種病原微生物進行核酸檢測,以協助臨床精準診斷、精準治療的方法。既往報道顯示[6],呼吸道病原體核酸十三項檢測在成人CAP肺泡灌洗液檢測中具有特異度強、敏感度高的特點,但在兒童CAP肺泡灌洗液檢測中的報道較少。因此,本研究對CAP患兒進行肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測,并進一步分析其與細菌培養的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年1月至2023年2月梅州市人民醫院收治并行纖維支氣管鏡肺泡灌洗的240例CAP患兒為研究對象。納入標準:(1)符合CAP相關診斷[7];(2)所有病例均行胸部CT檢查;(3)年齡29 d～14歲;(4)經纖維支氣管鏡醫師評估,計劃行纖維支氣管鏡肺泡灌洗術。排除標準:(1)標本不符合要求;(2)新生兒;(3)醫院獲得性或非感染性肺炎患兒。240例患兒中,男性122例,女性118例,年齡(6.78±2.23)歲。本研究通過醫院倫理委員會審批,所有研究對象及家屬均知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 痰細菌培養 患兒在進行抗生素治療前采集痰標本。采取前30 min禁食、水,用生理鹽水漱口。常規消毒后,護士持連接負壓裝置的一次性吸痰器經患兒口腔進行深部吸痰,收集痰液1～2 mL,及時送至微生物室檢測。痰培養合格標本判斷標準為:每低倍鏡視野上皮細胞<10個,白細胞>25個。將合格痰液標本接種于培養基,置于培養箱孵育(35 ℃,5% CO2),根據培養基上的菌落特點、革蘭染色及鏡下形態等,對致病菌進行鑒定及藥敏試驗,具體操作及結果判讀依據微生物檢驗標準。

1.2.2 肺泡灌洗液標本獲取 由纖維支氣管鏡醫師在護士配合下完成纖維支氣管鏡操作。完善內鏡檢查前進行局麻或全麻,根據患兒年齡及體重選擇合適內鏡,經鼻將支氣管鏡送至病變支氣管內,經支氣管鏡工作孔注入0.9%生理鹽水,注入量1 mL/kg,每次<10 mL,注入3～5次。采用負壓吸引器吸取支氣管肺泡灌洗液,棄去第1次肺泡灌洗液,將之后吸取的肺泡灌洗液分別用作細菌培養及呼吸道病原體核酸十三項檢測。

1.2.3 肺泡灌洗液細菌培養 將獲得的肺泡灌洗液標本及時送至微生物室,將標本接種于培養基,置于培養箱孵育(35 ℃,5%CO2),根據培養基上的菌落特點、革蘭染色及鏡下形態等,對致病菌進行鑒定及藥敏試驗,具體操作及結果判讀依據微生物檢驗標準操作程序。

1.2.4 肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測 采用核酸提取試劑提取患兒肺泡灌洗液標本中DNA和RNA(提取步驟按照試劑盒說明進行),將提取到核酸與十三項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒擴增試劑混合后(按照擴增試劑盒說明進行)進行聚合酶鏈反應擴增,將擴增后樣本進行雜交檢測。使用Luminex Magpix液相芯片檢測平臺,通過聚合酶鏈反應儀進行雜交顯色,并完成檢測。檢測內容包括13種臨床常見呼吸道病原體(肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團菌、大腸桿菌、結核分枝桿菌)。

1.3 統計學分析

采用SPSS 24.0軟件對數據進行統計學分析。計數資料采用[n(%)]形式描述,組間比較行獨立樣本χ2檢驗/Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痰細菌培養

240例痰液標本中,細菌培養結果陽性44例,陽性率18.34%(44/240)。各病原檢測率均不高,其中以流感嗜血桿菌(9.17%)及肺炎鏈球菌(5.83%)為主。見表1。

表1 痰細菌培養結果[n(%)]

2.2 肺泡灌洗液細菌培養結果

240例肺泡灌洗液標本中,細菌培養結果陽性者19例,陽性率7.93%。各病原菌檢測陽性率較低,其中感染病原體以肺炎鏈球菌(3.75%)及流感嗜血桿菌(2.08%)為主,且檢測出1例煙曲霉復合菌。見表2。

表2 肺泡灌洗液細菌培養結果[n(%)]

2.3 肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測

240例肺泡灌洗液標本中,呼吸道病原體核酸十三項檢測結果陽性者140例(58.33%),140例陽性患兒共檢測出病原體162株。其中,革蘭氏陽性菌84株,其中,肺炎鏈球菌78例、金黃色葡萄球均6例、耐甲氧西林葡萄球菌0例、以肺炎鏈球菌為主,占比為48.15%(78/162);革蘭氏陰性菌34株,其中,肺炎克雷伯菌2例、銅綠假單胞菌4例、鮑曼不動桿1例、嗜麥芽窄食單胞菌5例、流感嗜血桿菌19例,嗜肺軍團菌0例、大腸埃希氏菌2例,結核分枝桿菌復合菌1例,以流感嗜血桿菌為主,占比為11.72%(19/162);支原體衣原體44株,以肺炎支原體為主,占比為26.54%(43/162)。見表3。

表3 肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測結果

2.4 三種檢測方式陽性率比較

240例患者中,痰細菌培養檢出陽性44例,陰性196例,陽性率18.34%(44/240);肺泡灌洗液細菌培養檢出陽性19例,陰性221例,陽性率7.92%(19/240);肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢出陽性140例,陰性100例,陽性率58.33%(140/240)。肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測的陽性率高于痰細菌培養及肺泡灌洗液細菌培養(P<0.05)。見表4。考慮到細菌培養不能檢測出肺炎支原體和衣原體,去掉肺炎支原體及衣原體的單一陽性病例39例,痰細菌培養總例數201例,陽性和陰性例數分別為44例和157例;肺泡灌洗液細菌培養檢測總例數201例,陽性和陰性例數分別為19例和182例。此時肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測的陽性率仍高于痰細菌培養及肺泡灌洗液細菌培養(P<0.05)。見表5。

表4 三種檢測陽性率比較[n(%)]

表5 去掉肺炎支原體及衣原體單一陽性病例后三種檢測陽性率比較[n(%)]

2.5 不同年齡組肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測病原體分布情況比較

<2歲、2～5歲,>5歲年齡組患兒的病原體感染率分別為44.00%(22/50)、61.27%(87/142)及64.58%(31/48)。<2歲年齡組感染率最低,低于2～5歲(χ2=4.493,P=0.034)及>5歲組(χ2=4.178,P=0.041),2～5歲組及>5歲組比較,差異無統計學意義(χ2=0.168,P=0.682)。

140例陽性患兒共檢測病原體162株,排名前三的是肺炎鏈球菌、肺炎支原體及流感嗜血桿菌;其中<2年齡組感染以肺炎鏈球菌為主,占比為53.85%(14/24);2～5歲年齡組感染以肺炎鏈球菌、肺炎支原體及流感嗜血桿菌為主,占比分別為52.94%(54/102)、21.57%(22/102)、12.75%(13/102);>5歲年齡組以肺炎支原體及肺炎鏈球菌為主,占比分別為50.00%(18/36)、27.78%(10/36)。見表6。

表6 不同年齡段肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測病原體分布情況[n(%)]

3 討論

兒童因自身免疫力低下及呼吸系統發育不完善,是呼吸系統疾病高發人群,CAP是兒童占比最高的疾病,也是全球兒童發病率和死亡率最高的疾病[8]。引起兒童CAP的病原體十分復雜,加上不同地區、不同年齡段及不同季節病原體構成比亦有顯著差異[9]。因此,為實施精準靶向治療,提高兒童CAP治愈率,需對病原體進行檢測分析。隨著纖維支氣管鏡的成熟應用,肺泡灌洗液作為檢測標本被廣泛應用。研究[10]顯示,肺泡灌洗液直接取材于病變部位,可避免上呼吸道正常菌群污染,能更準確反映肺部病原學。本研究中,CAP患兒肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測陽性率高于痰培養和肺泡灌洗液細菌培養,表明肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測可提高CAP患兒病原體檢測陽性率,對臨床診療具有較高價值。

一直以來,痰液作為最常規且最易獲得的標本在臨床上廣泛使用,但痰液標本不僅在采集時易被污染,在培養過程中也易被污染。同時,CAP患兒年齡小,配合度低,不愿配合深部吸痰取得標本。而標本獲取是檢測病原體準確性的關鍵[11]。相較于痰液,肺泡灌洗液是通過支氣管鏡取得,直接來源于病灶,不易受上氣道正常菌群干擾,樣本質量更高[12]。因此,肺泡灌洗液標本可準確反映呼吸系統疾病病原體情況。李小夢等[13]研究表明,對痰培養陰性的原發性肺隱球菌病患者,肺泡灌洗液培養是其有效診斷手段。本研究顯示,呼吸道病原體核酸十三項檢測陽性率高于痰培養及肺泡灌洗液細菌培養,由此表明,肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測可作為CAP患兒病原體診斷的最適方案。本研究中,肺泡灌洗液細菌培養陽性率低于既往結果,原因可能與本研究肺泡灌洗液標本是在經驗性治療3～4 d后取得有關,也可能與本研究中肺炎支原體感染占比較高有關,而細菌培養僅能診斷細菌感染,對支原體感染無法診斷。雖然痰培養和肺泡灌洗液細菌培養的陽性率不及肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測,但二者能診斷出十三項之外的細菌,如本研究肺泡灌洗液細菌培養液診斷出1例煙曲霉復合菌。一旦診斷出此種不常見呼吸道細菌,經過藥敏試驗可指導臨床用藥,提高臨床治愈率[12,14]。

導致CAP的病原體較復雜,臨床上易存在單一感染與混合感染的情況,但通過傳統痰液及肺泡灌洗液細菌培養較難發現混合感染而準確診斷。本研究中,肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測可同時檢出兩種或多種病原體。其中,陽性率最高的肺炎鏈球菌和肺炎支原體多以單一感染存在,流感嗜血桿菌單一感染與混合感染比例接近;而肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞、銅綠假單胞菌多以混合感染的形式存在。因此,肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測是CAP患兒有效診斷手段,尤其是有助于臨床明確混合感染病原體,避免經驗性用藥,減少不必要的抗生素聯用。

有研究對195個國家下呼吸道感染數據進行分析,2016年全球死于肺炎的兒童有100萬左右,其中,<5歲兒童占比為15%左右[15]。因此,本研究將5歲作為一個臨界點。分析不同年齡組患兒肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測病原體分布情況顯示:<2歲年齡組感染率最低,低于2～5歲及>5歲組。原因可能是小嬰兒感染多以病毒感染為主,而呼吸道病原體核酸十三項主要包含下呼吸道常見的8種病原菌及5種其他病原體,不包含病毒。本研究還顯示,排名前三的病原體是肺炎鏈球菌、肺炎支原體及流感嗜血桿菌;其中,肺炎鏈球菌、肺炎支原體及流感嗜血桿菌占比均以2～5歲年齡組最高。<2年齡組感染以肺炎鏈球菌為主;2～5歲年齡組感染以肺炎鏈球菌、肺炎支原體及流感嗜血桿菌為主;>5歲年齡組以肺炎支原體及肺炎鏈球菌為主。由此表明,肺炎鏈球菌是導致兒童CAP最主要原因。近年來流行病學研究[16-17]顯示,肺炎支原體已逐步成為兒童CAP的重要致病菌,其檢出率為20%～40%,本研究檢出43株,檢出率為26.54%(43/162)。本研究中,>5歲是肺炎支原體占比最高人群,亦與上述結果一致。

綜上,肺泡灌洗液呼吸道病原體核酸十三項檢測可提高CAP患兒病原體陽性率,是一種確定CAP病原體種類有效方法,值得臨床推廣使用。