基于VEGF/VEGFR信號通路探討貝伐珠單抗對腸癌SW480細胞生物學行為的影響及其機制

樊葉,李超,汪志兵

(南京醫科大學附屬南京醫院·南京市第一醫院消化科,江蘇 南京 210006)

腸癌是常見的消化道惡性實體瘤之一,2016年全球癌癥發病率和死亡率統計顯示,我國等發展中國家腸癌的發病率逐年上升,成為僅次于胃癌和肺癌的第三大癌癥[1]。早期腸癌癥狀不明顯,檢出率較低,有數據[2]表明,約25%的患者在確診時已處于晚期,錯過了根治性手術切除的最佳治療時機,同時因腸癌的轉移率和復發率較高,放射療法和化學療法效果也不佳,且存在嚴重的毒副作用[3],導致患者預后較差。貝伐珠單抗是近些年來新發現的對于腸癌有較好療效的人源化單克隆抗體,通過靶向血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)并抑制其生物活性[4],顯著抑制腫瘤新生血管生成和腫瘤轉移,在腸癌等實體瘤中發揮重要的抑制作用。VEGF是調節血管新生和血管生成動態平衡的高度特異性分子[5],與血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)共同作用,參與調控腫瘤細胞增殖、分化和凋亡等過程[6],影響腸癌等多種惡性腫瘤疾病進展。然而,目前尚不清楚貝伐珠單抗是否可以直接通過調控VEGF/VEGFR信號通路影響腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等細胞周期。基于此,本研究擬通過VEGF/VEGFR途徑探究貝伐珠單抗對腸癌細胞生物學的影響,并初步了解其作用機制。

1 方法

1.1 細胞培養

人腸癌細胞系SW480購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫,與含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的培養液混合,置于改良的無糖RPMI-1640培養基中,保持37 ℃的溫度和5%的CO2濃度進行常規培養,每隔3 d更換1次完全新鮮的培養基,待細胞融合至80%以0.25%胰蛋白酶消化后進行傳代,取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2 藥物處理

采用不同濃度(0、25、50、100、200 μg/mL)的貝伐珠單抗(上海羅氏制藥有限公司)處理人腸癌細胞系SW480細胞,37 ℃的溫度和5%的CO2濃度下培養48 h,收集處理后的含藥SW480細胞,檢測其增殖、遷移、侵襲、凋亡水平。

1.3 細胞活力檢測

采用CCK8計數試劑盒檢測細胞活力,取經過上述不同濃度的貝伐珠單抗處理后的各組SW480細胞,按5×103個/孔的密度接種于96孔板中,培養48 h后加入CCK8溶液,每孔各10 μL,嚴格按照說明書要求操作。共同培養2 h,采用酶標儀(山東競道光電科技有限公司)分別檢測不同時間(0、24、48、72 h)下波長為450 nm處各組細胞的吸光度值,實驗重復3次。

1.4 細胞遷移和侵襲能力檢測

采用Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力,取對數生長期的上述各組細胞,Transwell上室用Matrigel基質膠進行包被或不進行任何操作,然后將細胞按照2×104個/孔放入Transwell上室中,另加600 μL含有胎牛血清的培養液于Transwell下室中,37 ℃的溫度和5%的CO2濃度下培養12 h,移除上室細胞,采用4%的多聚甲醛固定Transwell下室中的細胞,再用0.1%的結晶紫染色,倒置熒光顯微鏡(南京貝登醫療股份有限公司)下觀察由上室穿過Transwell濾膜進入下室的細胞數,分析細胞遷移和侵襲情況,實驗重復3次。

1.5 細胞凋亡檢測

取不同濃度的貝伐珠單抗處理后的各組SW480細胞,采用Annexin V-FITC雙染法進行細胞凋亡檢測。將各組細胞按照2×106個/孔接種于6孔板中,培養24 h后采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細胞3次,經洗滌過的細胞重懸于150 μL Binding Buffer結合緩沖液中,向緩沖區的細胞懸液中滴加10 μL的Annexin V-FITC試劑以及5 μL碘化丙啶染色液,輕搖離心管使其充分混合,2～8 ℃下避光孵育15 min,采用AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒(武漢普諾賽生命科技有限公司)說明書檢測各組細胞凋亡水平,實驗重復3次。

1.6 VEGF/VEGFR信號通路檢測

采用Western blot法檢測細胞內VEGF/VEGFR信號通路的蛋白表達,取經不同濃度的貝伐珠單抗處理后的各組SW480細胞,移除培養基,PBS洗細胞1次,采用RIPA裂解液裂解細胞后提取蛋白,BCA法檢測蛋白含量。將提取到的蛋白經聚丙烯酰胺恒溫下1 000 V電泳1 h后轉膜,室溫封閉2 h后加入VEGF、VEGFR1、VEGFR2和β-actin單克隆抗體(Abcam公司,稀釋比均為1∶2 000)室溫下孵育過夜,常規洗膜后與二抗(Abcam公司,稀釋比均為1∶1 000)室溫下孵育1 h,再次洗滌后以ECL發光試劑(湖南一諾唯真科技有限公司)顯影,Image J軟件掃描并測量感光條帶,分析以β-actin作為內參時各組VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白的相對表達,實驗重復3次。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度的貝伐珠單抗對腸癌細胞增殖的影響

貝伐珠單抗濃度依賴性地抑制腸癌細胞體外增殖(P<0.05)。見圖1。

2.2 不同濃度貝伐珠單抗對腸癌細胞遷移的影響

Transwell檢測各組細胞遷移水平,結果顯示,貝伐珠單抗濃度依賴性地抑制腸癌細胞體外遷移(P<0.05)。見圖2。

2.3 不同濃度貝伐珠單抗對腸癌細胞侵襲的影響

Transwell檢測各組細胞侵襲水平,結果顯示,貝伐珠單抗濃度依賴性地抑制腸癌細胞體外侵襲(P<0.05)。見圖3。

2.4 不同濃度貝伐珠單抗對腸癌細胞凋亡的影響

AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒檢測各組細胞凋亡情況,結果顯示,貝伐珠單抗顯著誘導了腸癌細胞的體外凋亡,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見圖4。

2.5 不同濃度的貝伐珠單抗對腸癌細胞內VEGF/VEGFR信號通路的影響

Western blot檢測經不同濃度的貝伐珠單抗處理后的各組腸癌細胞內VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達,結果顯示,隨著貝伐珠單抗濃度的增加,VEGF的表達顯著下調,VEGFR1和VEGFR2的表達顯著上調(P<0.05)。見圖5。

3 討論

隨著基因技術的發展和對腸癌研究的不斷加深,有學者[7-8]提出,腸癌細胞生物學行為受到轉化生長因子β1、VEGF等多種細胞因子的影響。VGEFR1和VEGFR2是VEGFR家族中的重要成員,其中VEGFR1在單核細胞等巨噬細胞系的細胞膜中高表達,參與細胞因子和趨化因子之間的信號轉導,刺激不同組織的炎癥反應和非炎癥反應[9],促進腫瘤血管、淋巴管生成和腫瘤轉移。VEGFR2具有較強的酪氨酸激酶活性,在血管內皮細胞中高表達,產生主要和直接的血管生成信號[10]。有報道[11-12]稱,VEGF在肺癌、卵巢癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中高表達,抑制VEGF的表達可阻斷腫瘤新生血管生成,被認為是多種癌癥的潛在免疫治療靶點。本研究發現,VEGF/VEGFR信號通路參與介導腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡,為腸癌的臨床治療提供了新的分子靶點和理論依據,這主要與VEGF與其受體家族中的VEGFR1和VEGFR2結合,可在惡性腫瘤疾病中參與細胞間的信號傳遞,調控細胞內的多種基因表達,進而影響疾病進展有關[13]。

貝伐珠單抗是治療胰腺炎、結腸癌等癌癥的重要靶向藥物,發揮顯著抗腫瘤血管生成作用,抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,抑制腸癌等癌癥的病情進展[14]。本研究結果顯示,貝伐珠單抗可濃度依賴性地抑制人腸癌細胞系SW480細胞的體外增殖、遷移和侵襲,誘導細胞凋亡,發揮顯著的抑癌效應。進一步的機制實驗也表明,貝伐珠單抗的抗腫瘤作用是通過抑制血管內皮生長因子VEGF的表達,上調血管內皮生長因子受體VEGFR1/2來實現的。這與貝伐珠單抗特有的生物活性有關,貝伐珠單抗可與VEGFR受體競爭性結合[15],上調VEGFR1、和VEGFR2的表達,阻斷VEGF的活性,下調VEGF的表達,抑制腫瘤新生血管和淋巴管生成[16],進而顯著抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲,并誘導細胞凋亡,與Itatani等[17]的研究結果相符。

綜上,貝伐珠單抗通過下調VEGF,上調VEGFR1和VEGFR2的表達,在體外顯著抑制腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲,誘導細胞凋亡,且貝伐珠單抗的抗癌效應隨著藥物濃度的增加而增強。