芒柄花素調節Nrf2/HO-1信號通路對急性肺栓塞大鼠肺組織損傷的影響

趙博韜,毛宏宇,姚春霞,吳清華

(1.滄州市中心醫院心內科,河北 滄州 062450;2.河北工程大學醫學院,河北 邯鄲 056000)

急性肺栓塞(acute pulmonary embolism,APE)是以各種栓子堵塞肺動脈從而引起呼吸功能和肺循環功能障礙,其病情兇險且病死率高[1]。栓子堵塞肺動脈可阻礙血液引起氧化應激損傷,導致肺動脈高壓;并且栓子可刺激血管內皮,引起炎癥反應進一步加重疾病[2-3]。目前,APE的治療以抗凝、溶栓等為主,但會增加出血風險,因此仍需探索新型有效的治療藥物。

芒柄花素(formononetin,FN)是一種在黃芪、雞血藤及紅車軸草中普遍存在的異黃酮類化合物,具有抗炎、抗菌和抗氧化特性[4]。芒柄花素對急性肺損傷具有保護作用[5];還可通過抑制大鼠肺血管重構減輕肺動脈高壓[6]。然而,FN對APE的治療作用及其可能的機制尚不清楚。核因子E2相關因子2(nudear factor E2-related factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-l)通路是抗氧化應激的關鍵信號通路,并且能夠調控核因子κB(NF-κB)表達與活化參與炎癥反應過程[7-8]。研究[9]發現,Nrf2是FN誘導HO-1表達的上游信號調節因子,當Nrf2沉默時,FN誘導的HO-1水平提升被顯著抑制,FN通過激活Nrf2/HO-1途徑發揮其抗炎和抗氧化作用,從而減輕小鼠高氧性急性肺損傷。但FN調控Nrf2/HO-1信號通路對APE大鼠肺組織損傷影響及作用機制尚未明確。因此,本實驗通過構建APE大鼠模型,探究FN調控Nrf2/HO-1信號通路對APE大鼠肺組織損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

從廣東維通利華實驗動物技術有限公司購入100只SD大鼠(SYXK(粵)2022-00683),雄性,體質量為(280±10)g,大鼠適應性飼喂1周。

1.2 試劑

芒柄花素(純度≥99.0%, 47752)、Nrf2抑制劑Brusatol(純度≥95.0%, SML1868)購自美國Sigma-Aldrich公司;低分子肝素鈣注射液購自深圳賽保爾生物藥業有限公司;B型腦鈉肽(BNP)(ml028489)、肌鈣蛋白Ⅰ(TnⅠ)(ml092662)、缺血修飾性白蛋白(IMA)(ml001923)檢測試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司;白細胞介素6(IL-6)(PI328)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(PT516)檢測酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)(799594)、丙二醛(MDA)(D799762)檢測試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;兔源一抗Nrf2抗體(ab31163)、HO-1抗體(ab68477)、NF-κB抗體(ab16502)、p-NF-κB抗體(ab76302)均購自英國Abcam公司。

1.3 主要儀器

ABL90血氣分析儀(丹麥雷度米特醫療設備有限公司);ELx808酶標儀(美國Lonza公司);BX51電動顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型建立 大鼠采用頸靜脈回輸自體血栓栓子建立APE模型[10]。經大鼠自身眼眶靜脈取血0.5 mL,待凝血后將凝塊分割成0.5×2 mm2大小的血栓栓子20個左右,吸入2 mL無菌注射器內,生理鹽水補足至2 mL制成血栓懸液備用。50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,于頸部右側做一約1 cm的縱行切口,游離頸靜脈后,經右側頸總靜脈迅速注入血栓懸液(約20個栓子),消毒并縫合。術后2 h內大鼠有發紺,呼吸加快、加深的癥狀出現表示成功建立APE模型。

1.4.2 實驗分組與給藥 88只大鼠建立APE模型,共造模成功72只,隨機分為APE組、低分子肝素鈣組(LMWH組)、低劑量FN組(L-FN組)、高劑量FN組(H-FN組)、Nrf2抑制劑Brusatol組(BR組)、高劑量FN+Brusatol組(H-FN+BR組),每組各12只;另取12只大鼠作為對照組(Control組),僅分離頸靜脈,不注射血栓懸液。造模后,L-FN組和H-FN組大鼠分別以30 mg/kg、60 mg/kg劑量腹腔注射FN溶液,LMWH組造模后立即腹腔注射低分子肝素鈣注射液(0.01 mL/kg)[9],BR組大鼠腹腔注射2 mg/kg劑量[11]Brusatol,H-FN+BR組大鼠腹腔注射60 mg/kg FN溶液和2 mg/kg Brusatol,Control組和APE組大鼠腹腔注射同量生理鹽水;1次/d,連續給藥7 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 動脈血氧分壓(PaO2)、氧合指數(OI)檢測 末次給藥16 h后,將大鼠麻醉,剪開腹腔,暴露腹主動脈,采用普通負壓管取血2 mL用于分離血清,并采用抗凝負壓管經腹主動脈取大鼠血液2 mL,血氣分析儀測量動脈血氧分壓(PaO2),計算氧合指數(OI)。OI=PaO2/吸入氧濃度(氧濃度為0.21)。

1.5.2 BNP、TnⅠ、IMA水平檢測 將普通負壓管中的血液離心(3 000 r/min,10 min),取上層血清。采用ELISA法測定BNP、TnⅠ、IMA水平,按試劑盒操作步驟進行。

1.5.3 肺組織病理檢查 取多聚甲醛固定的肺組織經脫水、透明、浸蠟、包埋及切片制作石蠟切片,切片厚度在4～6 μm,制作好的切片再經脫蠟、水化、浸染、分化、返藍等步驟進行HE染色,再分別浸泡于70%、80%、90%以及100%梯度酒精1 min,二甲苯浸泡5 min,中性樹膠封片,在光學顯微鏡下進行觀察。

1.5.4 血清中炎癥因子檢測 采用ELISA法測定血清IL-6、TNF-α水平,按說明書嚴格操作。制備標準品并繪制標準曲線,取血清置于冰上備用,每孔加入樣品100 μL,37 ℃孵育2 h,加入炎性抗體于檢測孔中,孵育、洗板、顯色,于450 nm處使用酶標儀測定吸光度值,計算各組大鼠IL-6、TNF-α水平。

1.5.5 肺組織氧化應激指標檢測 肺組織勻漿后,3 000 r/min離心10 min,吸取上清液于96孔板中,酶標儀中測定吸光度值(檢測波長450 nm),計算各組大鼠SOD、MDA水平,操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.5.6 Westernblot法檢測Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白水平 Western blot檢測Nrf2、HO-1、NF-κB、p-NF-κB蛋白水平,肺組織勻漿后,提取總蛋白。按照試劑盒操作步驟通過Tris-甘氨酸SDS-PAGE分離蛋白質并轉移到硝酸纖維素膜上,經4 ℃封閉過夜,然后將硝酸纖維素膜有蛋白一面置于一抗Nrf2、HO-1、NF-κB、p-NF-κB稀釋液(稀釋比例1∶1 000)中孵育過夜,取硝酸纖維膜洗凈一抗后常溫下二抗孵育1 h,TBST洗脫4次。滴加ECT顯影液檢測蛋白質印跡,分析目標蛋白灰度值。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠動脈血PaO2、OI比較

與Control組比較,APE組大鼠動脈血PaO2、OI降低(P<0.05)。與APE組比較,LMWH組、L-FN組和H-FN組大鼠動脈血PaO2、OI升高(P<0.05),BR組大鼠動脈血PaO2、OI降低(P<0.05);與L-FN組比較,LMWH組和H-FN組大鼠動脈血PaO2、OI升高(P<0.05);與H-FN組比較,H-FN+BR組大鼠動脈血PaO2、OI降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠動脈血PaO2、OI比較

2.2 各組大鼠BNP、TnⅠ、IMA水平比較

與Control組比較,APE組大鼠BNP、TnⅠ、IMA水平升高(P<0.05);與APE組比較,LMWH組、L-FN組和H-FN組大鼠BNP、TnⅠ、IMA水平降低(P<0.05),BR組BNP、TnⅠ、IMA水平升高(P<0.05);與L-FN組比較,LMWH組和H-FN組大鼠BNP、TnⅠ、IMA水平降低(P<0.05);與H-FN組比較,H-FN+BR組大鼠BNP、TnⅠ、IMA水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠BNP、TnⅠ、IMA水平比較

2.3 各組大鼠肺組織病理變化比較

Control組大鼠肺組織結構清晰完整;APE組大鼠肺組織可觀察到肺泡破裂,有滲液,間質水腫,并伴有大量炎性細胞浸潤;LMWH組、L-FN組和H-FN組肺組織病變減輕,LMWH組和H-FN組病理變化改善更為明顯;BR組大鼠肺組織病變較APE組加重,肺泡壁增厚進一步增厚,肺泡腔內可見大量炎癥細胞浸潤;H-FN+BR組大鼠肺組織病變較H-FN組加重,炎性細胞增多。見圖1。

2.4 各組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α水平比較

與Control組比較,APE組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05);與APE組比較,LMWH組、L-FN組和H-FN組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05),BR組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05);與L-FN組比較,LMWH組和H-FN組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05);與H-FN組比較,H-FN+BR組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α水平比較

2.5 各組大鼠肺組織SOD、MDA水平比較

與Control組比較,APE組大鼠肺組織SOD水平降低,MDA水平升高(P<0.05);與APE組比較,LMWH組、L-FN組和H-FN組大鼠肺組織SOD水平升高,MDA水平降低(P<0.05),BR組大鼠肺組織SOD水平降低,MDA水平升高(P<0.05);與L-FN組比較,LMWH組和H-FN組大鼠肺組織SOD水平升高,MDA水平降低(P<0.05);與H-FN組比較,H-FN+BR組大鼠肺組織SOD水平降低,MDA水平升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肺組織SOD、MDA水平比較

2.6 各組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、NF-κB、p-NF-κB蛋白水平比較

與Control組比較,APE組大鼠Nrf2、HO-1水平降低,p-NF-κB/NF-κB升高(P<0.05);與APE組比較,LMWH組、L-FN組和H-FN組大鼠Nrf2、HO-1水平升高,p-NF-κB/NF-κB降低(P<0.05),BR組大鼠Nrf2、HO-1水平降低,p-NF-κB/NF-κB升高(P<0.05);與L-FN組比較,LMWH組和H-FN組大鼠Nrf2、HO-1水平升高,p-NF-κB/NF-κB降低(P<0.05);與H-FN組比較,H-FN+BR組大鼠Nrf2、HO-1水平降低,p-NF-κB/NF-κB升高(P<0.05)。見圖2及表5。

表5 各組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、p-NF-κB蛋白水平比較

3 討論

APE常引起肺梗塞,導致肺實質缺血、出血和最終壞死[12]。BNP和TnⅠ是臨床上APE常用的診斷指標,能夠有效預測肺血栓短期預后狀況[13]。此外APE的發生發展與IMA水平升高密切相關[14]。對高危APE患者來說,體內低氧血癥會更加明顯,肺動脈壓急劇增高,血清中BNP的水平顯著升高[15]。IMA可用作評估APE嚴重程度的臨床標志物。崔波等[16]研究發現,在APE患者中IMA水平呈高水平表達。在本研究中,APE大鼠肺組織可見肺泡破裂融合,有滲液,間質區水腫且大量炎性細胞浸潤,PaO2、OI、SOD水平降低,BNP、TnⅠ、IMA、IL-6、TNF-α、MDA水平升高。由此可知,APE不僅會引起機體BNP、TnⅠ、IMA升高,還有誘導炎癥反應和氧化應激,損傷肺組織。

研究[17]表明,FN能夠通過激活Nrf2/HO-1信號傳導,抑制氧化應激以及炎癥反應,對甲氨蝶呤腎毒性大鼠發揮保護作用。Zhou等[18]發現,在深靜脈血栓大鼠模型中,FN可減少血栓形成并抑制促炎介質IL-1β和IL-18的分泌,改善靜脈血栓。此外,胡志平等[19]研究顯示,FN可通過促進Nrf2/HO-1通路激活,抑制氧化應激反應,減輕腦外傷小鼠腦水腫并改善其行為障礙。以上研究表明FN具有顯著的抗炎和抗氧化作用。在本研究中,低、高劑量FN可降低BNP、TnⅠ、IMA、IL-6、TNF-α、MDA水平,升高SOD水平,減輕APE大鼠肺組織病變。這與既往的研究結果一致,進一步證實了FN具有抗炎、抗氧化能力;提示FN可抑制炎癥和氧化應激,改善APE大鼠肺組織損傷。

Nrf2和Kelch樣ECH相關蛋白(Keap1)在細胞質中以二聚體的形式結合,當受到刺激時,Nrf2會從Keap1上解離并轉移到細胞核中,從而誘導編碼的相關酶HO-1的表達[20]。HO-1是Nrf2的下游信號蛋白,具有催化血紅素降解作用,其降解產物膽綠素具有較強的抗氧化活性,因而Nrf2/HO-1信號通路表現出抗氧化能力[21]。Huang等[22]的研究發現,在IL-13刺激的人鼻上皮JME/CF15細胞中,FN預處理可促進Nrf2的核移位,抑制IL-13誘導的JME/CF15細胞中促炎性細胞因子的分泌。NF-κB是一種由p50/p65二聚體形成的核轉錄因子,研究發現在機體病理狀態下能夠誘導NF-κB磷酸化為p-NF-κB p65,其具有誘導炎性因子轉錄表達能力,加重炎癥反應。Hao等[23]研究表明,FN通過激活Nrf2/HO-1信號通路,抑制炎癥和氧化應激,防止順鉑誘導的急性腎損傷。在本研究中,APE大鼠肺組織Nrf2、HO-1水平降低,p-NF-κB/NF-κB升高,提示Nrf2/HO-1信號通路表達受到抑制,NF-κB通路激活;且Nrf2抑制劑Brusatol可進一步抑制Nrf2/HO-1信號通路,加重APE大鼠肺組織損傷,表明APE大鼠肺損傷與Nrf2/HO-1信號通路的活化被抑制有關。給予FN處理后,APE大鼠肺組織Nrf2、HO-1水平升高,p-NF-κB/NF-κB降低,提示FN可誘導Nrf2/HO-1信號通路激活,抑制NF-κB磷酸化。為了進一步驗證FN對APE大鼠肺損傷的保護機制,本研究在FN處理的基礎上采用Nrf2抑制劑Brusatol進行干預,發現Brusatol可降低APE大鼠肺組織Nrf2、HO-1水平,升高NF-κB磷酸化水平,減弱FN對APE大鼠肺損傷的保護作用。由此可見,FN可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路,抑制NF-κB磷酸化,保護APE大鼠肺組織損傷。

綜上,FN可通過抑制氧化應激和炎癥反應減輕APE大鼠肺損傷,改善大鼠肺功能,其可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路實現的。本研究表明FN可能是一種有前途的治療APE的藥物,可能為APE的治療提供新的選擇和研究方向。在未來的研究中,將采用體外細胞實驗,深入驗證FN對APE發揮保護作用的分子機制。此外,APE的機制復雜,FN是否能通過其他途經發揮保護作用仍需進一步研究。