達烏里胡枝子根瘤菌的促生作用及高效根瘤菌的鑒定

摘要：本研究選擇達烏里胡枝子（Lespedeza daurica）根瘤分離且結瘤效果較好的7株根瘤菌（TG64，TG97，TG98，TG100，TG101，TG105和TG115），通過測定達烏里胡枝子生長表型和主要營養成分，結合結瘤和光合特性初步分析促生的生理生化機制，研究不同根瘤菌的促生作用；通過分子生物學、形態學和生理生化特性鑒定高效根瘤菌。結果表明：除TG64，其余菌株顯著提高了株高、根長、生物量和蛋白質含量，改善了根系構建，TG101促生最明顯。所有處理單株結瘤5～33個，根瘤干重2.55～35.87 mg；TG98，TG100，TG101和TG115顯著提高了葉綠素含量、光合和氮吸收能力，是促生的主要生理生化機制。經鑒定，TG101為格木慢生根瘤菌（Bradyrhizobium erythrophlei）。綜上，根瘤菌通過改善植株氮營養促進葉綠素合成、增強光系統活性，提高光合能力，進而促進干物質積累調控生長。其中TG101為高效根瘤菌，為后續研發適用黃土高原的達烏里胡枝子根瘤菌劑提供了菌種資源和理論依據。

關鍵詞：達烏里胡枝子；根瘤菌；篩選；鑒定

中圖分類號：S813.9""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）06-1819-13

Promoting-growth Effect of Rhizobia from Lespedeza davurica

and Identification of Efficient Rhizobium

ZHONG Hua1，2，3#， YANG Kai-yuan1，2，3#， QIN Yun-meng1， GAO Peng1，2，3，

HUANG Chen1，2，3， JIANG Lin1，2，3， ZHAO Xiang1，2，3*

（1.College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 2 Key Laboratory of Model

Innovation in Forage Production Efficiency， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 3 Shanxi

Key Laboratory of Grassland Ecological Protection and Native Grass Germplasm Innovation， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：In this study，seven rhizobium strains （TG64，TG97，TG98，TG100，TG101，TG105 and TG115） isolated from nodules of Lespedeza daurica with good nodulation effect were selected. By measuring the growth phenotype and main nutritional components of L. davurica，combined with nodulation and photosynthetic characteristics，the physiological and biochemical mechanisms of growth promotion were preliminarily analyzed，and the growth promotion effects of different rhizobia were explored. Finally，the efficient rhizobium was identified by molecular biology，morphology and physiological and biochemical characteristics. The results showed that except for TG64，the other strains significantly increased the plant height，root length，biomass and protein content，and significantly improved the root construction of the plant. Among them，the promoting-growth effect of TG101 was the best. All strains were nodulated after inoculation，the number of nodules was 5-33 per plant，and the dry weight of nodules was 2.55-35.87 mg per plant. TG98，TG100，TG101 and TG115 significantly increased the chlorophyll content，photosynthetic capacity and nitrogen absorption capacity of the plants，which were the main physiological and biochemical mechanisms for promoting growth. TG101 with the best growth-promoting effect was identified as Bradyrhizobium erythrophlei. In conclusion，the rhizobia promoted the synthesis of chlorophyll，enhanced the activity of photosystem，and improved the photosynthetic capacity by improving the nitrogen nutrition of plants，thus promoting the accumulation of dry matter and regulating its growth. Among them，TG101 with the best growth-promoting effect was an efficient rhizobium，which provided strain resources and theoretical basis for the subsequent development of rhizobium agents suitable for L. davurica in the Loess Plateau，China.

Key words：Lespedeza daurica;Rhizobia;Screening;Identification

氮素（Nitrogen）是限制豆科植物生長發育的最主要元素之一［1］。盡管大氣中存在大量的氮，但大多以極穩定狀態存在，不能被植物吸收利用［2］。根瘤菌（Rhizobium）能夠與豆科植物共生，形成根瘤（Nodule）固定大氣中的氮供自身及周圍植物利用，是生物固氮（Biological nitrogen fixation）中效率最高的體系［3］。根瘤菌促進植物生長發育主要體現在兩方面，一是豆科植物-根瘤菌共生體（Legume-rhizobium symbioses）不僅能夠固氮，還通過改善植株的光合特性促進干物質積累，進一步提高產量（生物量）；二是可促進根系生長，增加根系吸收面積，進而提高根毛對營養元素的吸收能力，促進植物對周圍環境養分的吸收和利用，調控其生長發育，改善品質［6］。豆科植物-根瘤菌共生體在提高土壤肥力，減少氮肥施用，改善生態環境等方面發揮積極作用［7］。因此，探究和開發根瘤菌對于農業生產及生態環境修復具有重要意義。

達烏里胡枝子（Lespedeza davurica）是豆科胡枝子屬的多年生草本狀半灌木，能夠與根瘤菌共生，具有很高的利用價值。其莖葉鮮嫩，富含蛋白質等營養元素，飼用價值高［8］；葉片富含黃酮類化合物，具有清熱解毒、降血脂等功效，可用于制茶［9］；根系較發達，耐旱耐貧瘠，是生態修復的先鋒草種［10］。達烏里胡枝子主要分布在我國北方、華中至云南等地的森林草原或草原地帶，黃土高原是其分布的幾何和多度中心。黃土高原地區土壤氮素匱乏，尤其是草地土壤全氮含量和氮密度均低于農田［13］，不利于達烏里胡枝子的生長發育及栽培利用。近年來，為緩解氮素匱乏的問題，人們大量使用氮肥，對土壤、水體和大氣等造成了嚴重的污染［14］。豆科植物-根瘤菌共生體作為一種綠色無污染的固氮方式，在生態環境保護以及農業綠色可持續發展方面逐漸受到重視。

目前，國內外有關胡枝子屬植物根瘤菌的研究主要集中于根瘤菌多樣性、促生效應等方面，研究地區包括韓國［20］、美國［21］以及我國的陜西、內蒙古、甘肅等。能夠與胡枝子屬植物共生固氮的根瘤菌有4屬，包括慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）和根瘤菌屬（Rhizobium）。接種根瘤菌能夠顯著提高胡枝子的結瘤率、根瘤數、根瘤鮮重以及植物生物量等。山西是達烏里胡枝子的主要分布區之一，但是目前尚未見包括該地區在內的我國達烏里胡枝子根瘤菌的系統研究。本研究選取前期從山西省達烏里胡枝子根瘤分離且具有較好結瘤效果的7株根瘤菌，通過盆栽試驗比較不同菌株對植株的促生效應，進一步對其生理生化機制進行分析，對高效根瘤菌進行鑒定，以期為研發適用于黃土高原地區的達烏里胡枝子根瘤菌劑提供菌種資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2021年從山西省種植的‘晉農1號’達烏里胡枝子根瘤中分離純化了88株根瘤菌，保存在含有30%甘油的凍存管中，置于—80℃超低溫冰箱。

菌種活化及菌懸液的制備：將保存的菌株從-80℃超低溫冰箱取出后，置于45℃水浴鍋中熱激5 min，使其快速復蘇。用無菌接種環將復蘇菌株劃線接種在YMA培養基上，28℃恒溫箱（MJ-I型，上海一恒公司）培養24 h。挑取單菌落接種在TY液體培養基，28℃、180 r·min-1恒溫振蕩培養箱（ZQLY-180E型，上海知楚公司）培養24 h。取10 mL上述培養液置于離心機（H2050R型，湖南湘儀公司）4℃、10 000 r·min-1離心10 min，倒去上清液，用無菌水沖洗3次，收集菌體。向獲得的菌體中加入5 mL無菌水，充分混勻，調節OD600為0.8，備用。

16S rRNA基因序列相似性：用無菌接種環挑取根瘤菌單菌落，置于盛有20 μL無菌水的PCR八連排管中，在PCR儀上95℃加熱7 min，4℃、10 000 r·min-1離心10 min取上清液作為模板DNA備用。利用細菌16S rRNA基因通用引物P1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′）和P6（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）對模板DNA進行擴增。PCR反應體系：2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，DNA模板（10 ng·μL-1） 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃ 5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。獲得的16S rRNA基因序列用生物信息學分析軟件DNAStar和SeqMan程序進行拼接和人工校對，編輯后獲得的序列提交美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫獲得登錄號，并利用EzBioCloud （https：//www.ezbiocloud.net/identify/）進行序列比對。

利用Fahreus半固體無氮培養基培養達烏里胡枝子幼苗并接種根瘤菌，進一步對其結瘤效果進行測定，最終選取了7株結瘤效果較好的根瘤菌作為供試菌株（表1）。

1.2 培養基及試劑

試劑均為國產分析純。酵母甘露醇瓊脂（Yeast mannitol agar，YMA）培養基參考文獻［25］配制，酵母蛋白胨（Tryptone yeast，TY）液體培養基參考文獻［26］配制。Gibson微量元素液和Fahreus無氮營養液參考文獻［27］配制。

1.3 根瘤菌對盆栽達烏里胡枝子的促生試驗

1.3.1 幼苗植株的培養 挑選一批籽粒飽滿、色澤形態一致的‘晉農1號’達烏里胡枝子種子（由山西農業大學草業科學實驗室提供），用5% NaCl溶液消毒5 min，最后用無菌水漂洗6～8次。用無菌鑷子將表面消毒完全的達烏里胡枝子種子播種到盛有無菌蛭石的花盆（內徑9 cm，高13 cm）中，每盆播種10粒，然后在溫度為25℃，光照周期為16 h/8 h（光照/黑暗），相對濕度為40%～50%的植物培養間培養，期間每周定期補充無菌水。在培養10 d后間苗，每盆留3株長勢一致的幼苗。

1.3.2 根瘤菌的接種 從幼苗生長第10天，即間苗結束后開始接種。用移液槍吸取1.1中OD600為0.8的根瘤菌菌懸液1 mL，接種在達烏里胡枝子幼苗莖基部，以接種無菌水的幼苗為對照，并每隔7 d再次接種，共接種3次，每個處理3次重復。接種完成后在植物培養間中培養，期間每周將花盆底部浸泡在Fahreus無氮營養液中吸水，保持基質濕潤。

1.3.3 根瘤菌促生作用的測定 形態和生長指標測定：在第1次接種90 d后取樣，利用直尺測定植株的垂直株高、根長，利用游標卡尺測定莖粗，利用根系掃描儀（LA-S型，杭州萬深公司）統計根系數據，用剪刀將植株地上部與地下部分離后，利用量筒測定植株根體積，利用分析天平分別測定植株和根瘤鮮重。將植株地上部和地下部分別裝入信封中，于105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重，稱重測定其地上部、地下部干重（生物量）。

結瘤特征的測定：利用游標卡尺測定根瘤直徑，利用分析天平測定根瘤鮮重。

根瘤投資（Investment to nodulation）的計算［10］：根瘤生物量占植株總生物量的比例。

全氮含量測定：使用連續流動分析儀（AA3型，德國SEAL公司）測定植株地上部分的全氮含量。

粗蛋白含量測定：全氮含量乘以系數6.25即為植株地上部分粗蛋白含量。

可溶性糖含量測定：利用蒽酮法測定植株地上部分可溶性糖含量。

黃酮含量測定：以蘆丁為對照品，利用分光光度法測定植株地上部分黃酮含量。

葉綠素相對含量的測定：利用便攜式葉綠素測定儀（SPAD-502PLUS型，日本柯尼卡公司）對達烏里胡枝子同一葉位葉片的葉綠素相對含量（SPAD）進行測定，每個處理3次重復。

葉片氣體交換參數測定：選取達烏里胡枝子植株的同一葉位葉片，利用便攜式光合儀測（CI-340型，美國CID公司）定凈光合速率（Net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導度（Stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（Intercellular CO2 concentration，Ci）、蒸騰速率（Transpiration rate，Tr），每個處理3次重復。將測量后的葉片取下，測定其葉面積。

葉綠素熒光參數測定：利用便攜式葉綠素熒光儀（PAM-2500型，德國WALZ公司），測定黑暗環境下適應20 min的達烏里胡枝子葉片的初始熒光（Fluorescence origin，Fo）、最大熒光（Fluorescence maximum，Fm）和PSⅡ最大光化學量子產量Fv/Fm（Maximal quantum yield of PSⅡ），并計算可變熒光（Variable fluorescence，Fv）Fv=Fm-Fo和PSⅡ潛在光化學效率（Potential photochemical efficiency of PSⅡ）Fv/Fo。

所述測定指標均為3次重復的平均值。

1.4 高效根瘤菌的鑒定

根據達烏里胡枝子的主要用途（飼草生產和生態修復），以植株的生物量、粗蛋白含量、氮含量、形態指標、葉綠素含量、光合指標以及結瘤指標來確定高效根瘤菌。

1.4.1 形態學鑒定 將高效根瘤菌TG101接種在YMA培養基上，28℃恒溫倒置培養，第7 d觀察菌落形態特征，測定直徑。進行革蘭氏染色、芽孢染色［28］，電鏡下觀察菌體形態特征，測量大小，測量重復50次。

1.4.2 生理生化特性鑒定 對高效根瘤菌TG101進行吲哚反應、接觸酶反應、淀粉水解反應、明膠液化反應和甲基紅反應的測定［29］。

1.4.3 分子生物學特性鑒定 使用MEGA 7.0軟件將高效根瘤菌TG101的序列與EZBioCloud數據庫中的模式菌株序列進行系統發育分析，采用鄰接法（Neighbor-Joining method）構建系統發育樹，自展值（bootstrap）為1 000次。

1.5 數據統計與分析

利用Microsoft Excel 2019整理數據，利用SPSS 26.0進行數據分析，對達烏里胡枝子的結瘤數、根瘤直徑、株高、根長、莖粗、根體積、植株生物量、根瘤生物量、葉片氣體交換參數、葉綠素相對含量、葉片葉綠素熒光參數等指標進行單因素方差分析和最小顯著性差異法（Least-Significant Difference，LSD）多重比較（Plt;0.05）。利用Origin 2021統計軟件繪制根瘤菌對達烏里胡枝子促生作用的柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 不同根瘤菌菌株對達烏里胡枝子生長的影響

除接種TG64，其余處理均使達烏里胡枝子的株高、根長和莖粗顯著提高（Plt;0.05）（圖1E）。與對照相比，株高提高了204.3%～414.5%（圖1A）；根長提高了72.4%～121.4%（圖1B）；莖粗提高了174.2%～300.0%（圖1C）。其中接種TG101的植株株高、根長和莖粗均最高，分別為52.35 cm、29.67 cm和1.78 mm。除接種TG64和TG105，其余處理使根體積顯著提高了433.3%～700.0%（Plt;0.05）。其中接種TG98的植株根體積最大，為1.50 mm3（圖1D）。

除接種TG64，其余處理均使達烏里胡枝子的根系長度、根系表面積、根系平均直徑、根系連接數和分叉數顯著提高（Plt;0.05）。與對照相比，根系長度提高了1.9～9.1倍，根系表面積提高了5.1～20.4倍，根系平均直徑提高了0.3～1.3倍，根系連接數提高了2.8～13.7倍，根系分叉數提高了2.8～14.5倍。其中，接種TG101的植株根系長度、根系連接數和分叉數最高，分別為1 028.13 cm、4 339.00個和2 656.00個；接種TG98的植株根系表面積和根系平均直徑最大，分別為199.50 cm2和0.71 mm。7株根瘤菌使達烏里胡枝子的根尖數顯著提高了1.3～8.5倍（Plt;0.05）。其中接種TG101和TG98的達烏里胡枝子根尖數最大，分別為674.00個和654.50個，顯著高于其余處理（Plt;0.05）（表2）。

2.2 不同根瘤菌菌株對達烏里胡枝子生物量的影響

除接種TG64，其余處理使達烏里胡枝子的生物量均顯著提高（Plt;0.05）。與對照相比，地上部鮮重提高了26.5～66.5倍（圖2A）；地下部鮮重提高了4.5～21.7倍（圖2B）；地上部干重提高了21.0～68.47（圖2C）；地下部干重提高了3.2～25.0倍（圖2D）。其中，接種TG101的植株地上部鮮重和地上部干重均為最高，分別為3.05 g和1.26 g；接種TG98的植株地下部鮮重和地下部干重均為最高，分別為1.65 g和0.38 g；并且接種TG98和TG101的植株地下部鮮重顯著高于其余處理（Plt;0.05）。

2.3 不同根瘤菌菌株對達烏里胡枝子營養品質的影響

7株根瘤菌均顯著提高了達烏里胡枝子的粗蛋白含量（Plt;0.05），與對照相比提高了170.1%～207.4%（圖3）。其中，接種TG101和TG115的植株粗蛋白含量顯著高于其余處理（Plt;0.05），分別為165.80和160.98 g·kg-1（圖3A）。TG97和TG115顯著提高了達烏里胡枝子的可溶性糖含量（Plt;0.05），與對照相比提高了4.2%～12.3%。TG64、TG100、TG101和TG115均顯著降低了植株可溶性糖含量，與對照相比降低了11.1%～27.9%（Plt;0.05）（圖3B）。僅TG98顯著提高了達烏里胡枝子的黃酮含量（Plt;0.05），與對照相比提高了6.5%。其余6株根瘤菌均顯著降低了植株黃酮含量，與對照相比降低了9.5%～39.4%（Plt;0.05）（圖3C）。

2.4 不同根瘤菌菌株對達烏里胡枝子結瘤特征的影響

7株根瘤菌的單株平均結瘤數量為5～33個·株-1，根瘤平均鮮重為12.93～199.03 mg，根瘤平均干重為2.55～35.87 mg。其中TG101的單株結瘤數量、根瘤平均鮮重和平均干重均最大，分別為33個，199.03 mg和35.87 mg。接種7株根瘤菌后，達烏里胡枝子的根瘤投資為2.03%～7.32%，其中接種TG64和TG97的植株根瘤投資顯著高于其他處理（Plt;0.05），分別為7.32%和4.67%，TG98的根瘤投資最低，為2.03%（表3）。

2.5 不同根瘤菌菌株對達烏里胡枝子全氮含量的影響

7株根瘤菌均顯著提高了達烏里胡枝子的全氮含量（Plt;0.05）。與對照相比提高了170.1%～207.4%。其中，接種TG101和TG115的植株全氮含量顯著高于其余處理（Plt;0.05），分別為26.53 g·kg-1和25.76 g·kg-1 （圖4）。

2.6 不同根瘤菌菌株對達烏里胡枝子葉綠素相對含量的影響

7株根瘤菌均顯著提高了達烏里胡枝子的葉綠素相對含量（Plt;0.05），其SPAD值與對照相比，提高了81.7%～150.4%。其中，接種TG101的植株SPAD值最高，為53.04，顯著高于其他處理（Plt;0.05），TG100除外（圖5）。

2.7 不同根瘤菌菌株對達烏里胡枝子光合特性的影響

接種TG98、TG100、TG101和TG115后，達烏里胡枝子的凈光合速率分別比對照顯著提高了67.4%、82.9%、127.1%和60.2%（Plt;0.05） （圖6）。其中，接種TG101的植株凈光合速率顯著高于其他處理（Plt;0.05），為14.76 μmol·m-2·s-1 （圖6A）。接種TG100、TG101和TG115后，植株的氣孔導度分別比對照顯著提高了100.2%、51.0%和82.3%（Plt;0.05）。其中，接種TG100的植株氣孔導度最高，為51.01 mmol·m-2·s-1，TG115次之，為46.46 mmol·m-2·s-1，TG101為38.47 mmol·m-2·s-1 （圖6B）。除接種TG105，其余處理使植株的蒸騰速率顯著提高了86.0%～164.8%（Plt;0.05）。其中，接種TG100的植株蒸騰速率最高，為0.60 mmol·m-2·s-1（圖6C）。接種TG97的植株葉片胞間CO2濃度有所降低，但是與對照間均無顯著差異（Plt;0.05）（圖6D）。

2.8 不同根瘤菌菌株對達烏里胡枝子葉綠素熒光特征的影響

除TG105，其余處理使達烏里胡枝子的最大熒光Fm顯著提高了4.4%～10.4%，可變熒光Fv顯著提高了7.0%～12.2%，最大光化學量子產量Fv/Fm均顯著提高1.3%（Plt;0.05），其中接種TG97的植株Fm最高，為4.26，接種TG97和TG115的植株Fv最高，均為3.22。接種TG97、TG100和TG101后，植株的PSⅡ潛在光化學效率Fv/Fo顯著提高了6.7%、6.1%和9.1% （Plt;0.05），其中接種TG101的植株Fv/Fo最高，為3.24（表4）。

2.9 高效根瘤菌TG101的分類地位

TG101的菌落為白色、圓形，邊緣完整，中心無隆起，菌落表面有光澤且不透明，質地粘稠，生長2 d的菌落直徑為3.47 mm（圖7A）。其革蘭氏染色為陰性（圖7B），無芽孢，菌體直桿狀，大小為（0.54～0.84） μm×（2.39～4.95） μm（圖7C，表5）。

在TG101的1%胰胨水溶液滴加Kovac試劑后，培養液層界面無紅色環出現，吲哚反應呈陰性。TG101與過氧化氫反應產生氣泡，過氧化氫酶反應呈陽性。在TG101的葡萄糖蛋白胨液體培養基滴加甲基紅試劑后，培養液呈淡黃色，甲基紅反應呈陰性。在淀粉瓊脂培養基上滴加碘液，菌落周圍無透明圈產生，淀粉水解反應呈陰性。在明膠培養基培養后，TG101無液化現象出現，明膠液化反應呈陰性（表6）。

高效根瘤菌TG101的GenBank登錄號為OQ710138，16S rRNA基因序列長度為1 430 bp。通過EZBioCloud數據庫比對和系統發育分析（圖8），TG101與模式菌株格木慢生根瘤菌（B. erythrophlei CCBAU 53325T 登錄號：KF114645）的同源性為99.85%。結合菌株形態學特征、生理生化特性，確定TG101為格木慢生根瘤菌。

3 討論

生長形態是反映植株生長狀況的最直觀特征，生物量能夠反映其生長狀況［30］。本研究中，接種TG97、TG98、TG100、TG101和TG115后，達烏里胡枝子的株高、根長、莖粗、根體積和地上、地下生物量均顯著提高。Sun等［31］研究發現，接種根瘤菌能夠顯著促進刺槐（Robinia pseudoacacia）幼苗生長，其株高、根系直徑和總生物量分別提高了44%，19%和123%。全紫曼等［32］研究表明，接種根瘤菌能夠顯著提高蠶豆（Vicia faba）的株高和生物量。Qu等［33］對鹽脅迫下的大豆接種根瘤菌，發現其生物量提高了10.95%～30.95%，本研究中接種根瘤菌后，植株地上生物量提高了26.5～66.5倍，遠高于該文獻的效果。本研究接種根瘤菌后，達烏里胡枝子的株高、根長、莖粗、根體積和生物量最高分別可提升414.5%，121.4%，300.0%，700.0%和68.47倍，具有良好的應用前景。根系是植物吸收水分和營養元素的關鍵器官，其生長狀況能夠反映植物的生長水平和抗逆性等特征［30］。其中根系長度和根表面積是衡量根系吸收范圍的重要指標，根系平均直徑、連接數、根尖數、分叉數等能夠衡量根系的吸收能力［34］。本研究中，接種TG97，TG98，TG100，TG101，TG105和TG115后，達烏里胡枝子的根系長度、根系表面積、根系平均直徑、根系連接數和分叉數均顯著提高。高文禮等［34］研究表明，接種根瘤菌提高了疏葉駱駝刺（Alhagi sparsifolia）的根系表面積和根系平均直徑，促進植株生長。郝鳳等［35］在接種根瘤菌對紫花苜蓿根系形態特征的研究中也得到了相似的結論。

生物固氮是豆科植物在整個生長發育過程中最主要的吸收氮素的途徑，根瘤是進行生物固氮的重要結構。根瘤數量和重量是評價根瘤菌結瘤能力的兩個重要指標［36］。通過盆栽試驗對7株根瘤菌的促生效應進行研究，發現TG97，TG98，TG100，TG101，TG105和TG115的結瘤數和根瘤干重顯著高于TG64，結瘤效果更好。根據前期采用分子生物學方法初步鑒定結果，發現TG97，TG98，TG100，TG101，TG105和TG115均為慢生根瘤菌屬，TG64為新根瘤菌屬，與伍惠等［37］的研究結論相似，慢生根瘤菌屬通常具有更好的結瘤固氮能力。根瘤投資能夠反映豆科植物的生物固氮能力［38］。結瘤固氮是一個高耗能過程，一般而言，豆科植物更傾向于以較低的根瘤投資獲取更多的氮營養［39］。本研究中，TG64和TG97的根瘤投資顯著高于其他接種處理，而結瘤數、根瘤干重等卻相對較低，其原因可能是TG64和TG97的固氮能力較差，植物需要投入更多的物質能量形成根瘤，來獲取足夠的氮以維持自身生命活動。后續將進一步對上述7株根瘤菌的固氮酶活性進行測定，定量分析其固氮能力。

氮素是構成植物葉綠素、蛋白質、核酸以及激素等成分的重要元素之一，在豆科植物生長發育過程中發揮重要作用［40］。豆科植物-根瘤菌共生體是豆科植物改善自身氮營養的主要途徑，本研究發現，接種根瘤菌后達烏里胡枝子的全氮含量顯著提高，并且其營養品質也顯著改善，尤其是蛋白質含量顯著提高，與關于接種根瘤菌對紫花苜蓿氮營養的研究相似。接種根瘤菌并未對達烏里胡枝子的黃酮產生明顯影響，因此上述菌株更適用于高蛋白飼草的生產。達烏里胡枝子作為優良的豆科牧草，具有良好的生態修復功能。根據其用途（飼草生產、生態修復），本研究確定以地上生物量、形態指標、粗蛋白含量、氮含量、葉綠素含量、光合指標以及結瘤指標來確定高效根瘤菌。TG101與其他菌株相比，在上述指標中的促進效果更優，因此將TG101確定為高效根瘤菌。在氮限制條件下，植株的葉綠素合成受阻，光系統活性受到抑制，并且氣孔導度會明顯降低，進而影響自身水分利用與氣體交換［44］，抑制光合作用，對生長造成不利影響。葉綠素作為植物進行光合作用的最重要色素分子，在光能的吸收和轉換過程中發揮著重要作用［45］，其含量直接影響植物的光合能力。本研究中，7株根瘤菌均顯著提高了達烏里胡枝子的葉綠素相對含量。孫慶圣等［46］研究減施氮肥和接種根瘤菌對大豆光合特性的影響發現，接種根瘤菌能夠顯著促進葉綠素的合成，進而提高大豆的凈光合速率，促進植株生長。菜豆［47］和大豆［48］接種根瘤菌的研究也得到了類似的結果，表明根瘤菌能夠通過固氮作用提高植株的氮營養，進而促進了葉綠素的合成。

葉綠素熒光動力學技術在測定植物光合作用的光系統對光能的吸收、傳遞、消耗和分配等具有重要作用，能夠從側面反應植物的光合功能［49］。其中，初始熒光Fo代表PSⅡ反應中心處于完全開放時的熒光產量；最大熒光Fm代表PSⅡ反應中心處于完全關閉時的熒光產量，反映了通過PSⅡ的電子傳遞情況；可變熒光Fv反映了QA的還原情況；最大光化學量子產量Fv/Fm反映了PSⅡ的原初光能轉化效率；Fv/Fo反映了PSⅡ的潛在光化學效率［50］。已有學者對達烏里胡枝子以及尖葉胡枝子等的光響應曲線特征進行了研究，均在上午9：30—11：30測定較好。本研究通過在上午9：30—11：30測定達烏里胡枝子的葉綠素熒光參數，發現接種根瘤菌顯著提高了其Fm、Fv和Fv/Fm，并且TG97、TG100和TG101還顯著提高了其Fv/Fo，與李馨園等［53］對大豆接種根瘤菌的研究結果一致，說明接種根瘤菌顯著改善了達烏里胡枝子的光系統活性，進而增強其光合作用。植物能夠通過光合作用固定光能轉化為有機物質供自身利用，光合作用是植物生長發育的保證［54］。凈光合速率是反映植物光合潛力的重要指標，也是決定植物生產力的根本因素［55］。本研究中，接種TG100、TG101和TG115顯著提高了達烏里胡枝子的凈光合速率。Raja等［41］發現田間接種根瘤菌能夠顯著提高紫花苜蓿的葉綠素含量、光系統活性等。孟捷等［56］研究發現，接種根瘤菌能夠顯著提高紫花苜蓿的凈光合速率，與本研究一致。

4 結論

7株根瘤菌與達烏里胡枝子的共生匹配性和結瘤效果較好，對盆栽植株有不同程度的促生作用。根瘤菌通過與達烏里胡枝子共生，形成根瘤發揮固氮作用改善植株的氮素營養，進而促進葉綠素的合成、改善光系統活性等方式增強其光合能力（凈光合速率），從而促進植株固定光能轉化為有機物質，調控其生長。其中，TG101對達烏里胡枝子的生物量、粗蛋白含量、氮含量、形態指標、葉綠素相對含量、光合指標以及結瘤指標等的促進效果最優，確定為高效根瘤菌，經分子生物學、形態學和生理生化特性鑒定為格木慢生根瘤菌，可作為后續研發適用于黃土高原地區的達烏里胡枝子根瘤菌劑的菌種資源。

參考文獻

［1］ TERPOLILLI J J，Hood G A，POOLE P S. What determines the efficiency of N2-fixing Rhizobium-legume symbioses？［J］. Advances in Microbial Physiology，2012，60：325-389

［2］ 曹克璠，劉嘉偉，索榮臻，等. 接種根瘤菌對‘蒙農三葉草1號’結瘤固氮及生長的影響［J］.草地學報，2023，31（12）：3876-3886

［3］ HERRIDGE D F，PEOPLES M B，BODDEY R M. Global inputs of biological nitrogen fixation in agricultural systems［J］. Plant and Soil，2008，311：1-18

［4］ 張旭輝，馬紹英，馬蕾，等. 接種根瘤菌對重茬豌豆植株生長及光合特性的影響［J］. 草地學報，2021，29（6）：1234-1241

［5］ 高文禮，陳曉楠，伊力努爾·艾力，等. 不同水分處理下雙接種叢枝菌根真菌和根瘤菌對疏葉駱駝刺生長及氮素轉移的影響［J］. 生態學報，2022，42（16）：6816-6826

［6］ 王二濤. 植物-根瘤菌共生固氮［J］. 中國基礎科學，2016，18（1）：21-27，22

［7］ 趙葉舟，王浩銘，汪自強. 豆科植物和根瘤菌在生態環境中的地位和作用［J］. 農業環境與發展，2013，30（4）：7-12

［8］ 趙祥，邢毅，董寬虎. 居群與生育期對達烏里胡枝子營養價值的影響［J］. 中國草地學報，2010，32（3）：112-116

［9］ 李鈺瑩，楊志青，蔣奇伸，等. 胡枝子茶殺青工藝研究及品質分析［J］. 草學，2021（4）：38-44

［10］王銀柳，耿倩倩，黃建輝，等. 氮肥和種植密度對達烏里胡枝子的生長與生物固氮的影響［J］. 植物生態學報，2021，45（1）：13-22

［11］黃瑾，姜峻，徐炳成. 黃土丘陵區達烏里胡枝子人工草地生產力與土壤水分特征研究［J］. 中國農學通報，2005（6）：245-248

［12］趙祥，董寬虎，張垚，等. 達烏里胡枝子根解剖結構與其抗旱性的關系［J］. 草地學報，2011，19（1）：13-19

［13］LIU Z P，SHAO M A，WANG Y Q. Spatial patterns of soil total nitrogen and soil total phosphorus across the entire Loess Plateau region of China［J］. Geoderma，2013，197：67-78

［14］GUO J，LIU X，ZHANG Y，et al. Significant acidification in major Chinese croplands［J］. Science，2010，327（5968）：1008-1010

［15］GU C T，WANG E T，SUI X H，et al. Diversity and geographical distribution of rhizobia associated with Lespedeza spp. in temperate and subtropical regions of China［J］. Archives of Microbiology，2007，188：355-365

［16］YAO Z Y，KAN F L，WANG E T，et al. Characterization of rhizobia that nodulate legume species of the genus Lespedeza and description of Bradyrhizobium yuanmingense sp. nov［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2002，52（6）：2219-2230

［17］WEI G H，TAN Z Y，ZHU M E，et al. Characterization of rhizobia isolated from legume species within the genera Astragalus and Lespedeza grown in the Loess Plateau of China and description of Rhizobium loessense sp. nov［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53（5）：1575-1583

［18］冀玉良，韋革宏. 商洛多花胡枝子根瘤菌16S rDNA-RFLP分析及系統發育研究［J］. 西北植物學報，2010，30（5）：925-932

［19］姚竹云，陳文新. 胡枝子屬根瘤菌的多相分類研究［J］. 微生物學報，1999（4）：3-11

［20］PALANIAPPAN P，CHAUHAN P S，SARAVANAN V S，et al. Isolation and characterization of plant growth promoting endophytic bacterial isolates from root nodule of Lespedeza sp［J］. Biology and Fertility of Soils，2010（46）：807-816

［21］BUSBY R R，RODRIGUEZ G，GEBHART D L，et al. Native Lespedeza species harbor greater non-rhizobial bacterial diversity in root nodules compared to the coexisting invader，L. cuneata［J］. Plant and Soil，2016，401：427-436

［22］劉振龍，蔡安國. 小冠花、胡枝子及檸條接種根瘤菌的效果［J］. 中國草地，1997（2）：81

［23］寧國贊，劉惠琴，白新學，等. 胡枝子根瘤菌優良菌種篩選及應用［J］. 土壤肥料，1995（5）：41-44

［24］王宏，翟賀民. 胡枝子丸衣化接種根瘤菌的效果［J］. 內蒙古草業，1995（1）：63-65

［25］趙龍飛，徐亞軍，曹冬建，等. 溶磷性大豆根瘤內生菌的篩選、抗性及系統發育和促生［J］.生態學報，2015，35（13）：4425-4435

［26］苗陽陽，周彤，師尚禮，等. 硼對根瘤菌在紫花苜蓿體內運移和定殖及對幼苗生長的影響［J］. 草業學報，2017，26（4）：120-133

［27］姚丹. 不同種屬PGPR菌株對紫花苜蓿-根瘤菌共生效率的影響［D］. 蘭州：蘭州大學，2021：26

［28］東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊［M］. 北京：科學出版社，2001：353-384

［29］沈萍，陳向東. 微生物學 ［M］. 第2版. 北京：高等教育出版社，2006：85-92

［30］姚丹，牛舒琪，趙祺，等. 梭梭根際枯草芽孢桿菌WM13-24對多年生黑麥草耐鹽性的影響［J］. 生態學報，2020，40（20）：7419-7429

［31］SUN Q，LIU Y，LIU H，et al. Interaction of biochar type and rhizobia inoculation increases the growth and biological nitrogen fixation of Robinia pseudoacacia seedlings［J］. Forests，2020，11（6）：711

［32］全紫曼，陳遠學，劉明，等. 成都平原蠶豆高效根瘤菌的篩選及其促生功能初步評價［J］. 植物營養與肥料學報，2019，25（6）：943-952

［33］QU L，HUANG Y，ZHU C，et al. Rhizobia-inoculation enhances the soybean’s tolerance to salt stress［J］. Plant and Soil，2016，400：209-222

［34］高文禮，陳曉楠，伊力努爾·艾力，等. 干旱及復水條件下接種AMF和根瘤菌對疏葉駱駝刺根系生長的影響［J］. 西北植物學報，2022，42（7）：1189-1197

［35］郝鳳，劉曉靜，齊敏興，等. 磷水平和接根瘤菌對紫花苜蓿根系形態特征和根瘤固氮特性的影響［J］. 草地學報，2015，23（4）：818-822

［36］郭佩，王佳藝，史曉龍，等. 施氮量對不同基因型花生結瘤特性及氮素利用的影響［J］. 沈陽農業大學學報，2022，53（4）：385-393

［37］伍惠，鐘喆棟，王學路，等. 與黑龍江大豆主栽品種匹配的優良根瘤菌篩選與鑒定［J］. 應用與環境生物學報，2018，24（1）：39-46

［38］BATTERMAN S A，WURZBURGER N，HEDIN L O. Nitrogen and phosphorus interact to control tropical symbiotic N2 fixation：a test in Inga punctata［J］. Journal of Ecology，2013，101（6）：1400-1408

［39］SACHS J L，QUIDES K W，WENDLANDT C E. Legumes versus rhizobia：a model for ongoing conflict in symbiosis［J］. New Phytologist，2018，219（4）：1199-1206

［40］馬雪峰，高旻，程治軍. 植物氮素吸收與利用的分子機制研究進展［J］. 作物雜志，2013（4）：32-38

［41］RAJA B L，AIT-EL-MOKHTAR M，MOHAMED A，et al. Green compost combined with mycorrhizae and rhizobia：a strategy for improving alfalfa growth and yield under field conditions［J］. Gesunde Pflanzen，2021，73（2）：193-207

［42］李莎莎，楊曌，李紅，等. 接種根瘤菌對紫花苜蓿產量和品質的影響［J］. 黑龍江畜牧獸醫，2021（20）：98-101，107

［43］劉憶，袁玲. 根瘤菌和AM真菌對紫花苜蓿結瘤和產質量的影響［J］. 土壤學報，2020，57（5）：1292-1298

［44］BROADLEY M R，ESCOBAR A J，BURNS A，et al. Nitrogen-limited growth of lettuce is associated with lower stomatal conductance［J］. New Phytologist，2001，152（1）：97-106

［45］黃持都，胡小松，廖小軍，等. 葉綠素研究進展［J］. 中國食品添加劑，2007（3）：114-118

［46］孫慶圣，原程，張玉先. 減施氮肥和接種根瘤菌對黑大豆光合特性及產量的影響［J］. 作物雜志，2022，（4）：132-137

［47］TAIRO E V，MTEI K M，NDAKIDEMI P A. Influence of water stress and rhizobial inoculation on the accumulation of chlorophyll in Phaseolus vulgaris （L.） cultivars［J］. Journal of Plant Nutrition and Soil Science，2017，15：1-13

［48］TAIRO E V，NDAKIDEMI P A. Bradyrhizobium japonicum inoculation and phosphorus supplementation on growth and chlorophyll accumulation in soybean （Glycine max L.）［J］. American Journal of Plant Sciences，2013，12：2281-2289

［49］李曉，馮偉，曾曉春. 葉綠素熒光分析技術及應用進展［J］. 西北植物學報，2006（10）：2186-2196

［50］張守仁. 葉綠素熒光動力學參數的意義及討論［J］. 植物學通報，1999（4）：444-448

［51］吳愛姣，徐偉洲，郭亞力，等. 不同水肥條件下達烏里胡枝子的光合-光響應曲線特征［J］. 草地學報，2015，23（4）：785-792

［52］楊秀芳，玉柱，徐妙云，等. 2種不同類型的尖葉胡枝子光合-光響應特性研究［J］. 草業科學，2009，26（7）：61-65

［53］李馨園，王守義，王淑榮，等. 根瘤菌配施膠質類芽孢桿菌對大豆葉綠素熒光特性、產量及品質的影響［J］. 大豆科學，2014，33（4）：541-544，549

［54］EVANS J R. Improving photosynthesis［J］. Plant Physiology，2013，162（4）：1780-1793

［55］趙洪賢，張洋軍，徐銘澤，等. 油蒿葉片氮分配對其最大凈光合速率季節變異的影響［J］. 生態學報，2022，42（17）：7156-7166

［56］孟捷，馬紅，李會軍，等. 2種根瘤菌對新牧1號苜蓿光合特征和生長的影響［J］. 新疆農業大學學報，2021，44（4）：241-247

（責任編輯 彭露茜）