青稞BBX基因家族鑒定及其對UV-B的響應

摘要：B-box（BBX）蛋白是植物中一類重要的轉錄因子，在控制植物生長發育、響應環境脅迫中起著重要作用。本研究從青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.f.）全基因組中鑒定出18個青稞BBX基因家族成員，分析了它們的理化性質、基因結構、進化關系及UV-B照射幼苗后的表達特性等。結果表明：青稞BBX基因的編碼序列（CDS）長度為636～2 223 bp；分子質量為22.07～54.29 kDa。系統發育分析將18個HvnBBX分為4個亞類。共線性分析表明青稞種內共產生4對片段復制形成的基因對，種間與玉米進化關系更近；HvnBBX啟動子區域包含與逆境脅迫、激素、生長發育等相關順式作用元件。轉錄組測序結果顯示UV-B照射后青稞葉片中有5個BBX基因（HvnBBX2/4/5/6/17）的表達量顯著下調，qRT-PCR驗證結果與轉錄組測序一致。上述結果為深入研究HvnBBX基因的抗紫外功能提供參考。

關鍵詞：青稞；BBX基因家族；UV-B照射；基因表達

中圖分類號：Q344+.13""" 文獻標識碼：A """"文章編號：1007-0435（2024）06-1760-10

Genome-Wide Identification of BBX Family Genes and It’s

Response to UV-B in Hulless Barley

CHEN Sheng-rong1， SHI Guo-min2， WANG Le1， HE Tao1*

（1.State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture， Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China;

2.College of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016 China）

Abstract：B-boxes （BBX） are a class of transcription factors in plants that play a crucial role in controlling plant growth，and responding to environmental stresses. In this study，18 members of the Hulless barley BBX gene family were identified from the whole barley genome. The physical and chemical properties，gene structure，evolution，and expression after UV-B irradiation of the 18 HvnBBX genes were analyzed. The results showed that the coding sequence （CDS） length of the BBX gene ranges from 636 to 2 223 bp，with a molecular mass of 22.07 to 54.29 kDa. The 18 HvnBBX genes were classified into 4 subcategories through phylogenetic analysis. Homology analysis revealed 4 gene pairs formed by segment duplication within the barley species，and interspecies analysis showed a closer relationship to maize in evolution. The HvnBBX promoter region contains cis-acting elements related to stress，hormones，and growth. RNA-Seq analysis revealed a significant decrease in the expression levels of 5 BBX genes （HvnBBX2/4/5/6/17） in barley leaves after UV-B irradiation. This variation in expression level was further confirmed by qRT-PCR. These findings provide a reference for further study of the anti-UV function of the BBX gene.

Key words：Hulless barley;BBX gene family;UV-B radiation;Gene expression

青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.f.）是一種大麥品種，在基因上與大麥（Hordeum_vulgare）高度相似［1-2］，主要生長在海拔3 000 m以上具有強紫外線（夏季UV-B輻射高約65 kJ·m-2）照射的高寒地帶［3-5］。青稞是青藏高原重要的糧食作物，廣泛應用于釀酒、飼料和食品加工［6］。逆境是影響作物生長的主要制約因素之一［7］，尤其是在青藏高原，青稞更容易受到UV-B照射脅迫。植物已經發展出多種策略來改善UV-B照射造成的有害影響［8］，如產生抗壞血酸鹽和類黃酮等額外的抗氧化保護劑［9-10］。然而，目前對青稞在高原逆境UV-B脅迫下的耐受機制尚不清楚。

BBX （B-box結構域蛋白）是一組鋅指蛋白轉錄因子，結構域包含一個或兩個長度為40～47個氨基酸殘基組成的B-box基序［11］。根據序列和7～Zn結合殘基的間距，B-box基序可分為B-box1和B-box2兩種類型。植物B-box結構域可以單獨存在，也可以與CCT結構域一起存在。根據包含BBX結構域的數量及是否含有CCT結構域，將BBX基因家族分為5個亞族［12-13］。部分B-box結構域不僅直接介導轉錄調控，還與其他轉錄因子相互作用，調節蛋白質活性，包括結合能力、轉錄活性、E3泛素連接酶活性等，形成精細的調控網絡，精確調控植物生長發育過程的許多方面。如BBX在植物的光形態建成、光周期控制開花［14］、避蔭、非生物脅迫、植物激素介導的生長發育、晝夜節律、衰老和花青素生物合成中發揮關鍵作用［15］。

目前，人們已在擬南芥（Arabidopsis thaliana （Linn.） Heynh.）［10］、蘋果（Malus pumila Mill.）［16］、玉米（Zea mays L.）［17］、小麥（Triticum aestivum L.）［18］、葡萄（Vitis vinifera Linn.）［19］、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）［20］、甘薯（Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill）［21］、矮牽牛（Petunia hybrida （J. D. Hooker） Vilmorin）［22］、大豆（Glycine max （L.） Merr.）［23］等多種植物中對 BBX基因家族進行了系統性鑒定與分析。BBX基因家族在不同物種中的數量存在顯著差異，且發揮多種生物學功能，如響應UV-B照射［24］、低溫［16］、高溫［25］、干旱［26］和鹽［27］等逆境脅迫，參與類黃酮生物合成等［28］。青稞是青藏高原重要的農作物。目前尚無對青稞BBX基因家族進行鑒定的研究報道。為此，本研究鑒定了青稞BBX基因家族成員，分析了各成員的蛋白質特性，染色體分布、保守基序及進化關系。采用轉錄組測序方法探究了UV-B照射處理后青稞葉片中18個HvnBBXs基因的表達特性，并進一步利用QRT-PCR驗證了其中5個有表達差異的HvnBBXs基因的表達量。以明確青稞BBX基因的表達特性及其在UV-B照射下的響應模式，為深入研究HvnBBX基因家族的抗紫外功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及UV-B照射方法

本試驗采用的青稞品種為‘藏青2000’。選擇顆粒飽滿的青稞種子，置于裝有濾紙的培養皿中發芽48 h，然后移栽到基質土中。放到培養箱培養，設置條件白天溫度為25 ℃，濕度為60%，光照時間為12 h，夜間溫度為20 ℃，濕度為60%。在基質土中培養14天，對大小長勢一致的青稞三葉期幼苗采用40 W主譜線為253.7 nm的UV-B燈管（UV-B313EL，上海）按照師生波［29］的方法模擬UV-B照射處理，取UV-B照射了4 h的青稞葉片用于轉錄組測序和qRT-PCR測試，未照射的葉片為對照組。

1.2 試驗方法

1.2.1 HvnBBX基因家族成員鑒定與理化性質分析 從擬南芥基因組數據庫TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）獲取擬南芥基因組數據及AtBBX基因家族蛋白序列。從ensembl數據庫中下載大麥基因組和gff注釋文件（https：//plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/Info/Index？db=core）。利用TBtools-II （v2.031）軟件［30］通過兩種方法鑒定青稞BBX基因家族成員。Blast功能鑒定：以擬南芥的BBX蛋白序列為基礎，對青稞全基因組蛋白序列進行搜索，刪除E-value大于0.000 05的基因，得到候選HvnBBX基因。HMM Search功能鑒定：在Pfam（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/text/Pf006 43/page=1#table）數據庫獲取BBX基因家族HMM模型（Pfam00643）文件，根據結構域進行篩選，得到候選的HvnBBX基因。最后利用TBtools提取兩種方法鑒定出的HvnBBX基因的交集，提取HvnBBX序列，篩選刪除蛋白序列重復的基因，最終得到HvnBBX基因成員。將得到的HvnBBX基因成員序列分別提交至ExPASY（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析網站，預測其分子量、氨基酸數目和等電點。利用WoLFPSORT （https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線網站進行亞細胞定位分析。

1.2.2 青稞BBX基因結構和保守結構域分析 基于Domain分析HvnBBX基因成員結構的保守性。利用Batch CD-Search進行預測，在NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）下載hitdate文件，使用TBtools軟件中的Visualize NCBI CDD Domain Pattern將蛋白保守序列的結果做成可視化圖。基于Motif分析成員序列保守特征，將HvnBBX蛋白序列提交到MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）網站鑒定HvnBBX蛋白的保守基序，參數設置為基序數量10個，其他為默認參數，下載MAST XML文件。使用TBtools軟件將蛋白保守序列的結果做成可視化圖。利用MEGA軟件構建系統發育樹。

1.2.3 多物種BBX蛋白系統發育樹的構建 下載玉米BBX基因家族的蛋白的氨基酸序列，以玉米、擬南芥和青稞為研究對象，利用MEGA11和TBtools軟件對3種物種的49個BBX氨基酸序列進行比對構建系統發育樹。

1.2.4 青稞BBX基因的染色體位置 利用TBtools的Gen Location Visualize from GTF/GFF功能對HvnBBX基因進行染色體定位。

1.2.5 青稞BBX基因家族的共線性分析 分別下載青稞、擬南芥、玉米、豇豆（Vigna unguiculata）、馬鈴薯基因組及其基因組注釋文件，利用TBtools軟件一步法完成共線性分析。設置E-value值為1e-10，分析得到共線性文件colinearity和分析后的新注釋文件gff，并對結果進行可視化，畫出circos圖。利用TBtools提取染色體長度和數量以及colinearity文件中的基因對。將分析的基因對與其在染色體上的位置進行匹配，生成基因對共線性可視化文件。

1.2.6 青稞BBX基因啟動子序列分析 首先利用TBtools提取青稞所有基因的啟動子區域，獲得青稞所有基因5′端上游2 000 bp的序列作為候選啟動子序列。其次輸入目標基因ID，提取目標基因的啟動子序列，提交到Plantcare （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網站進行順式作用元件預測，整理和簡化PlantCare分析結果。最后利用TBtools對順式作用元件進行可視化。

1.2.7 UV-B照射下青稞BBX基因表達分析 收集UV-B照射后的青稞葉片液氮凍存，由廣州基迪奧公司利用Illumina HiseqTM 4000平臺進行轉錄組測序，每個處理分別設置3個生物學重復。測序結果經過篩選，數據庫比對注釋基因，然后利用FDR值與差異倍數log2FC篩選差異基因，設置值為FDRlt;0.05，|log2FC|≥1。根據鑒定得到的HvnBBX基因序列在轉錄組測序結果中查找每一個HvnBBX基因成員，得到青稞葉片中BBX基因的轉錄表達譜（TPM值）。利用TBtools繪制HvnBBX基因的表達熱圖。根據轉錄組測序分析結果，通過qRT-PCR對5個BBXs（BBX4，BBX9，BBX13，BBX14，BBX15）成員的表達特性進行驗證。使用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（中國，DP441）提取RNA。使用寶生物快速反轉錄試劑（中國，RR092）試劑盒進行cDNA合成。使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II定量PCR試劑盒（中國，RR820X）進行qRT-PCR。利用Primer Premier6軟件和在線設計網址（www.oligoarchitect.com）設計qRT-PCR引物，引物序列如表1所示。以青稞Actin作為內參基因。相對定量計算使用2-ΔΔct法，設置3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 青稞BBX基因家族成員鑒定

利用B-box結構域HMM profile （PF00643）文件搜索和以擬南芥BBX蛋白序列進行Blast兩種方法在青稞基因組中共鑒定得到18個HvnBBX基因。根據它們在青稞染色體上的分布，依次命名為HvnBBX1～HvnBBX18，如表2所示。HvnBBX基因的編碼序列（CDS）長度為636～2 223 bp；蛋白的分子質量為22.07～54.29 kDa；除了HvnBBX14之外其他成員的等電點都小于7，說明HvnBBX蛋白富含酸性氨基酸，屬酸性蛋白。亞細胞定位預測結果顯示，HvnBBX有3個（HvnBBX2，HvnBBX5，HvnBBX14）定位在葉綠體中，其他成員都定位在細胞核中。

2.2 青稞BBX基因家族結構和保守基序分析

青稞BBX蛋白的進化樹和保守基序分布如圖1（a），（b）所示。經過MEME軟件檢索后共得到10個保守基序（Motif）。進化樹中距離較近的蛋白具有相似的保守基序結構，同一類成員之間所含Motif種類類似，例如，HvnBBX3與HvnBBX12、HvnBBX4與HvnBBX15、HvnBBX14與HvnBBX16等進化樹距離較近，含有相同的保守基序。同時，青稞的18個BBX蛋白都含有Motif1，13個HvnBBX蛋白都含有Motif9，占全部蛋白數量的72%。根據擬南芥BBX基因的結構［16］和多序列比對判斷Motif1可能為B-Box結構域，Motif2為CCT結構域。同時，分析了青稞BBX基因保守結構域如圖1（c），9個HvnBBX包含2個B-box結構域，8個包含1個B-box結構域和1個CCT結構域，只有HvnBBX13只包含1個B-box結構域。如圖1（d）所示，HvnBBX基因所包含的外顯子數量在2～5之間，其中含有3個外顯子的基因占大多數。除HvnBBX1，HvnBBX8基因外，其他基因都至少含有一個UTR區，且UTR區域長度大小不一。

2.3 青稞BBX基因家族的系統發育分析

利用構建的系統發育樹，分析青稞、擬南芥和玉米之間BBX蛋白的進化關系。根據系統發育樹的拓撲結構和之前擬南芥中BBX基因家族的報道［16］，3個物種的BBX蛋白家族成員可分為五個亞家族（分別為A，B，C，D，E），如圖2所示。其中五個亞組中四個都包含有來自擬南芥、玉米和青稞BBX蛋白。結果表明，第一個亞家族（A）中包含7個 AtBBX、11個 ZmBBX和4個HvnBBX。第二個亞家族（B）只有一個HvnBBX17，有9個AtBBX和3個ZmBBX。第三個亞家族（C）中包含9個HvnBBX、8個AtBBX和13個ZmBBX，包含的青稞BBX蛋白數量最多。第四個亞家族（D）中包含有4個HvnBBX、6個AtBBX和5個ZmBBX，而第五個亞家族（E）中只包含2個AtBBX和1個ZmBBX，不包含青稞HvnBBX。

2.4 青稞中BBX基因染色體定位分析

HvnBBX基因在染色體上的分布如圖3所示，HvnBBX基因在染色體上的分布不均，除1H染色體外，其余6條染色體上均有HvnBBX分布，其中3H和4H只分布一個基因，分布最多的是6H，有7個成員。

2.5 青稞BBX基因家族的同源分析

對青稞種間和種內BBX基因家族成員進行了共線性分析，結果如圖4所示。18個HvnBBX基因種內共產生4對片段復制形成的基因對，分別是HvnBBX14/HvnBBX17，HvnBBX3/HvnBBX12，HvnBBX2/HvnBBX11和HvnBBX9/HvnBBX18。同時，分析了擬南芥、馬鈴薯、豇豆和玉米的共線性關系。結果顯示HvnBBX基因與擬南芥有1對直系同源基因對，與馬鈴薯有1對，與豇豆有2對，與玉米有32對（圖5）。說明青稞與玉米的BBX基因家族具有更近的同源性進化關系。

2.6 青稞BBX基因啟動子區順式作用元件分析

為了進一步了解HvnBBX基因在脅迫反應中轉錄水平上的調控作用，利用PlantCARE數據庫分析了青稞18個HvnBBX基因上游2 000 bp序列中的順式作用元件（圖6）。結果顯示，HvnBBX基因啟動子區順式作用元件種類豐富，包含脫落酸響應元件（Abscisic acid responsiveness，ABRE）、生長素響應元件（Auxin responsive element，TGA-element）、赤霉素響應元件（GARE-motif和P-box）、茉莉酸甲酯（MeJA）響應元件（TGACG-motif和CGTCA-motif）和水楊酸響應元件（TCA元件），防御和應激響應元件（TC-rich repeats）、創傷響應元件、干旱（DRE）和低溫響應元件（LTR），參與細胞周期、玉米醇溶蛋白代謝、晝夜節律、厭氧誘導、分生組織表達、種子特異性調控、胚乳發育、干旱和低溫等。另外還包含參與類黃酮生物合成響應元件。通過上述結果推測HvnBBX基因可能在青稞響應逆境脅迫、生物合成等方面具有多種生物學功能。

2.7 青稞BBX基因UV-B照射下的表達模式

利用鑒定得到的HvnBBX基因序列，在基迪奧公司的在線平臺OmicShare上Blast檢索HvnBBX基因。得到18個HvnBBX基因的表達量TPM值，繪制熱圖，如圖7（a）所示。其中有5個基因HvnBBX2，HvnBBX4，HvnBBX5，HvnBBX6和HvnBBX17在UV-B照射后表達量下調，說明UV-B照射在一定程度上抑制了這5個HvnBBX基因的表達，推測這些成員可能介導青稞葉片對UV-B照射的響應。為了進一步鑒定響應UV-B照射的HvnBBX基因，利用qRT-PCR驗證了青稞中HvnBBX2，HvnBBX4，HvnBBX5，HvnBBX6和HvnBBX17基因的表達特性。qRT-PCR驗證的結果與轉錄組測序結果一致，它們的表達量顯著下調（P＜0.05），如圖7（b）所示。因此，HvnBBX2，HvnBBX4，HvnBBX5，HvnBBX6和HvnBBX17可能是響應UV-B照射的潛在基因，其具體功能有待進一步研究。

3 討論與結論

青稞作為高海拔地區重要的糧食作物，探究其抵御UV-B照射的分子機制具有重要意義。而BBX是植物中一類重要的轉錄因子，在植物生長發育中發揮重要的調控作用。本研究從青稞基因組中共鑒定到18個HvnBBX基因。在不同植物中BBX基因家族成員數目各不相同，如擬南芥有35個［12］、玉米有34個［17］、馬鈴薯有30個［20］、葡萄有25個［19］、白樺（Betula platyphylla Suk.）有19個［31］；青稞BBX基因的編碼序列（CDS）長度為636～2 223 bp；蛋白的分子質量為22.07～54.29 kDa；大部分成員等電點小于7，屬于酸性蛋白。HvnBBX蛋白的編碼序列長度和分子量變化范圍較大，這些分子特性與以上列舉的物種不一致，說明該基因家族成員在物種間存在多樣性［32］。基序分析表明，所有BBX蛋白均具有1～2個B-box結構域，部分成員具有CCT保守結構域。不同組間的HvnBBX基序具有明顯的差異，而在同組成員之間具有相似的保守基序，這表明了BBX基因家族成員之間進化的保守性。類似的結果也普遍存在于其它植物中，如甘薯［21］、草莓（Strawberry）［33］、矮牽牛［34］等。青稞BBX基因中的外顯子數量為2～4個，大多數為3個，表明BBX基因結構在青稞中高度保守。通過系統發育分析，青稞BBX蛋白的分類與它們的結構域比對并不完全一致，BBX基因家族成員屬于一個結構群，可能在進化過程中失去了一個B-box結構域［32］。

通過RNA-seq分析和qRT-PCR驗證，有5個HvnBBX成員（HvnBBX2，HvnBBX4，HvnBBX5，HvnBBX6和HvnBBX17）在UV-B照射后表達量顯著下調，qRT-PCR結果顯示HvnBBX5對UV-B照射的響應變化最明顯。說明UV-B照射對這些基因的表達量產生了負向調節作用，推測它們可能在UV-B信號調控的生理過程中發揮重要作用。這些基因可能充當響應UV-B脅迫的調節因子，參與調控相關的生物學過程。研究表明擬南芥中AtBBX32與AtBBX21相互作用抑制HY5基因表達，從而抑制UV-B光應答基因表達，影響花青素合成［35］。同時，AtBBX24通過與HY5形成非活性的異源二聚體來抑制HY5表達，響應UV-B照射［36］。在番茄中也證實SlBBX20/21與SlHY5形成轉錄因子模塊在UV-B信號傳導中激活和負反饋調控相關基因的表達［24］。另外，通過COP1調控基因的轉錄組分析結果發現在UV-B條件下，COP1促進BBX5和BBX18的表達，抑制BBX7和BBX8的表達［37］。因此不同的BBXs在介導UV-B信號過程中可能存在交叉、冗余或差異，其具體的分子功能還需要后續生物學驗證。同時，本研究在青稞葉片轉錄組測序數據中沒有找到顯著上調的HvnBBX基因，可能與選擇的UV-B照射時間和強度等有關，例如玉米中的一些基因只有在一定的UV-B照射劑量閾值以上才會被誘導，這表明在不同的照射劑量下，不同的信號通路會起作用［38-40］，該內容需要進一步做深入研究。

綜上所述，通過對青稞基因組中的BBX進行系統鑒定和分析，本研究揭示了青稞的BBX在結構上表現出高度保守性。在UV-B照射條件下的表達水平發生了變化，其中HvnBBX5呈現最顯著的下調趨勢。這表明這些基因可能在植物對UV-B光的響應中發揮著重要作用，類似于其他植物中BBX基因家族成員參與UV-B信號傳導途徑的調節作用。此外，研究還發現了青稞BBX基因家族與擬南芥和玉米等物種的同源進化關系，為進一步探索其在逆境應答和生物合成等方面的生物學功能提供了基礎。通過轉錄組測序分析和qRT-PCR驗證，本研究深入了解了UV-B脅迫下HvnBBX基因的表達模式，為未來農作物育種和逆境應對機制的研究提供了有益的參考。

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（責任編輯 劉婷婷）