黑果枸杞YABBY轉錄因子家族鑒定與生物信息學分析

摘要：為探究黑果枸杞（Lycium ruthenicum）YABBY基因家族在鹽脅迫下的耐鹽分子機制，本文采用生物信息學方法，對黑果枸杞轉錄組數據庫中YABBY家族成員的理化性質、保守結構域、進化樹及表達模式進行分析。結果表明，黑果枸杞轉錄組數據中共篩選出10個YABBY家族成員，分布在YAB1/YAB3，YAB2和YAB5亞家族中。蛋白質亞細胞定位預測結果表明，其家族成員主要定位于細胞核。黑果枸杞YABBY家族蛋白分子量介于11 676.16～23 751.85 D；等電點介于6.47～9.62；總原子數介于1 584～3 294；氨基酸個數介于106～213 aa；脂溶指數介于55.06～81.04；不穩(wěn)定系數介于26.38～70.05；蛋白成員均為親水蛋白。LrYABBY家族的蛋白質C端具有YABBY保守結構域，無規(guī)則卷曲和α-螺旋占比較大。表達分析證明，NaCl脅迫株的不同器官中LrYABBYs具有不同的表達趨勢，LrYABBY10在根中高表達，LrYABBY8在葉中高表達，表明其可能在黑果枸杞鹽脅迫響應中發(fā)揮重要作用。該結果為黑果枸杞YABBY家族及其鹽脅迫響應方面的進一步研究提供參考。

關鍵詞：黑果枸杞；NaCl脅迫；YABBY轉錄因子；生物信息學分析

中圖分類號：S722.3+6""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）06-1729-13

Identification and Bioinformatics Analysis of YABBY

Transcription Factor Family in Lycium ruthenicum

LIU Yun1， LI Xiao-xiong2， JIA Xi-bei1， Ma Rui1， LIU Di1， DU Yu1， HU Xiao-tong1， MA Yan-jun1*

（1. Forest College， Gansu Agriculture University， Lanzhou， Gansu Province 730070， China; 2. Lan Zhou Resources amp;

Environment Voc-tech University， Lanzhou， Gansu Province 730030， China）

Abstract：To investigate the salt tolerance molecular mechanism of the YABBY gene family in Lycium ruthenicum under salt stress，the bioinformatics methods was used to study and analyze the physicochemical properties，conserved domains，evolutionary trees，and expression patterns of YABBY family members in the transcriptome database of Lycium ruthenicum. The results showed that a total of 10 members of the YABBY family genes were screened from the transcriptome data of Lycium ruthenicum，belonging to the YAB1/YAB3，YAB2，and YAB5 subfamilies. The prediction results of protein subcellular localization indicated that its family members are mainly located in the nucleus. The molecular weight of the YABBY family proteins ranged from 11 676.16 to 23 751.85 D. The isoelectric point ranged from 6.47 to 9.62. The total atomic number was between 1 584 and 3 294. The number of amino acids ranged from 106 to 213 aa. The lipid solubility index ranged from 55.06 to 81.04. The instability coefficient ranged from 26.38 to 70.05. All of LrYABBY proteins were hydrophilic proteins. The C-terminal of LrYABBY proteins had YABBY conserved domain，random curling and α-helix occupy a large proportion. Expression analysis had shown that LrYABBYs had different expression trends in different organs of NaCl stressed plants. LrYABBY10 was highly expressed in the roots，while LrYABBY8 was highly expressed in the leaves，indicating that it maight play an important role in the response of Lycium ruthenicum to salt stress. This result provided a reference for further research on the YABBY family genes of Lycium ruthenicum and their salt stress responses.

Key words：Lycium ruthenicum;NaCl treatment;YABBY transcription factor;Bioinformatics analysis

YABBY 是種子植物特有的一個小轉錄因子家族［1-2］，YABBY蛋白屬于鋅指蛋白家族，其特征是在N端有一個C2C2鋅指結構域和C端的YABBY結構域［3-6］。YABBY 基因參與植物中的多種生物過程［7］，如葉及葉衍生器官的發(fā)育［8-10］，花的形成和發(fā)育［10-12］，種子的發(fā)育［13］，果實發(fā)育［13-16］和干旱、鹽脅迫等過程［17-19］。將大豆（Glycine max）GmYABBY10基因在擬南芥中超表達，發(fā)現脅迫處理可以抑制轉基因植株種子的萌發(fā)、植株的根長和根表面積，推測大豆的GmYABBY10可能是植物在應對干旱和鹽脅迫等抗性環(huán)境中的負調節(jié)因子，玉米（Zea mays）YABBY基因家族在抗旱和抗鹽的逆境脅迫應答方面也可能發(fā)揮負調控作用［17］。菠蘿（Ananas comosus）AcYABBY4基因在擬南芥中過表達，發(fā)現NaCl處理下導致根系短，表明AcYABBY4在抗鹽脅迫中具有負調控作用［19］。紫花苜蓿（Medicago sativa）中發(fā)現 MsYABBY2 響應鹽、堿、干旱等逆境脅迫，推測其可能在抗逆境脅迫中起到關鍵的調節(jié)作用［20］。

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）的多年生落葉小灌木植物，生長于西北鹽堿地［21-23］。其果實中含有豐富的氨基酸、維生素C、花青素和脂肪等，并可廣泛應用于紡織、醫(yī)藥、輕工等領域，在植物中素有“軟黃金”之美稱［24］。它具有較強的抗寒、抗旱、耐鹽堿等能力，是我國西北鹽堿荒漠地區(qū)的重要植物［25-26］。所以研究其耐鹽分子機理對于人工栽培和良種選育具有現實意義。

目前已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）［27］、水稻（Oryza sativa）［28］、小麥（Triticum aestivum）［29］、煙草（Nicotiana tabacum）［30］、辣椒（Capsicum annuum）［31］、石榴（Punica granatum）［32］、荷花（Nelumbo nucifera）［33］、毛果楊（Populus trichocarpa）［34］、草莓（Fragaria vesca）［35］、陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（Gossypium barbadense）［36-37］等多種植物中鑒定出YABBY轉錄因子家族成員，但在黑果枸杞中尚未有YABBY基因的相關研究報道。本研究基于不同濃度NaCl在不同浸泡時間處理下的黑果枸杞轉錄組數據，通過生物信息學方法系統(tǒng)的鑒定了黑果枸杞YABBY基因家族成員，并分析其理化性質、亞細胞定位、保守結構域、蛋白質結構、系統(tǒng)進化樹及表達模式，為之后深入研究YABBY基因在黑果枸杞抗鹽方面所能發(fā)揮的作用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗中所用植物材料是保存于甘肅農業(yè)大學林學院組培實驗室內的黑果枸杞組培苗。組培的條件：光照強度是700 μmol·m-2·s-1，光照時間為每天16個小時，相對濕度是65%，晝夜溫度保持在22℃/20℃（±2℃）范圍。培養(yǎng)基的配方：2.47 g·L-1的1/2MS培養(yǎng)基，0.2 mg·L-1的NAA，0.2 mg·L-1的IBA，5 g·L-1的瓊脂，20 g·L-1的蔗糖，pH值為5.7。于配置好的培養(yǎng)基中快繁黑果枸杞組培苗，兩周后取生長健康且長勢相對一致的黑果枸杞組培苗，煉苗5天。煉苗后的黑果枸杞組培苗清理根部殘留的培養(yǎng)基，移栽至裝有配置的1/2Hoagland營養(yǎng)液（pH=5.7）的PC培養(yǎng)盒（長10 cm，寬10 cm，高10 cm）中，培養(yǎng)兩周后對其進行鹽脅迫（NaCl）處理。NaCl處理方式為，在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中分別加入0 mmol·L-1，50 mmol·L-1和250 mmol·L-1的NaCl，對移入營養(yǎng)液兩周后的黑果枸杞進行鹽脅迫處理，然后于0 h、1 h和12 h分別取樣。以相同的NaCl處理方式對此樣本均做3個生物學重復。經過NaCl處理后，取其不同方位且生長良好的主根與完整葉片為本試驗樣品對象，選取的測試樣品重量約0.1 g（表1），采集的樣品用液氮速凍并保存于-80℃的超低溫冰箱中備用。將提取和純化的RNA樣品密封送至上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司進行轉錄組測序。Illumina 平臺得到的原始數據采用Trimmomatic軟件對其進行質量預處理，之后使用Trinity軟件和CD-HIT軟件得到最終序列［38-39］。

1.2 生物信息學分析

1.2.1 黑果枸杞YABBY基因家族成員的鑒定 黑果枸杞轉錄組數據在NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）的登錄號SRR7700825［40-41］。在 Pfam 數據庫（http：//pfam.xfam.org/）下載YABBY家族（PF04690）［28，36，42-43］的隱馬爾可夫模型文件（Hidden Markov Model，HMM），使用TBtools軟件［44］進行數據初篩，之后根據YABBY家族蛋白質保守結構域為YABBY，用NCBI Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件和SMART（https：//smart.embl.de/）在線軟件再次篩選，最終得到黑果枸杞YABBY基因家族成員。

1.2.2 黑果枸杞YABBY家族的蛋白質亞細胞定位預測及理化性質分析 在WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線軟件預測黑果枸杞YABBY家族的蛋白質亞細胞定位，Expasy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對黑果枸杞YABBY家族的蛋白質理化性質進行分析，用Expasy-ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件分析黑果枸杞YABBY蛋白家族的親疏水性，使用Signa1P-6.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service/Signalp-6.0/SignalP）在線軟件預測黑果枸杞YABBY家族的蛋白質信號肽，圖1是使用ChiPlot（https：//www.chiplot.online/）在線軟件繪制。

1.2.3 黑果枸杞YABBY家族的蛋白質結構和保守結構域分析 在SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線軟件進行黑果枸杞YABBY家族蛋白質二級結構預測和分析，SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件對黑果枸杞YABBY家族蛋白質三級結構預測和分析。MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線軟件分析黑果枸杞YABBY家族的保守基序，使用TBtools軟件對LrYABBY 蛋白的系統(tǒng)進化樹、LrYABBY蛋白預測的保守結構域和保守基序進行數據可視化。

1.2.4 黑果枸杞YABBY家族的系統(tǒng)進化分析 在TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥YABBY基因家族，番茄（Solanum lycopersicum L.）YABBY基因家族和煙草YABBY基因家族于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載，利用MEGA-X軟件的工具MUSCLE進行黑果枸杞、番茄、煙草和擬南芥YABBY蛋白的多序列比對，然后使用MEGA-X的領接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并把Bootstrap參數設置為100 0。圖5是使用ChiPlot TVBOT（https：//www.chiplot.online/tvbot.html）［45］在線軟件繪制黑果枸杞、番茄、煙草和擬南芥YABBY蛋白家族的系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 黑果枸杞YABBY基因家族的表達模式分析 根據黑果枸杞YABBY轉錄組的表達量 FPKM（Fragments per kilobase per million reads）Sequenced值［38］，使用ChiPlot在線軟件繪制圖6和圖7，并對其進行分析。

2 結果與分析

2.1 黑果枸杞YABBY基因家族的成員鑒定

通過YABBY家族的隱馬爾可夫模型文件和使用TBtools軟件初篩黑果枸杞YABBY家族成員之后，進一步在NCBI Conserved Domains和SMART上，以YABBY家族蛋白質保守結構域為YABBY而去除無此結構域的序列，最終得到黑果枸杞YABBY基因家族成員共10個（表2）。

2.2 黑果枸杞YABBY家族的蛋白質亞細胞定位預測及理化性質分析

黑果枸杞YABBY家族中除LrYABBY6和LrYABBY10蛋白質亞細胞定位預測于葉綠體，LrYABBY7亞細胞定位預測在細胞質，LrYABBY9亞細胞定位預測是細胞外基質，其余6個蛋白質亞細胞定位預測均于細胞核（圖1），并且10條蛋白質序列都不含有信號肽。黑果枸杞YABBY蛋白分子量介于11 676.16～23 751.85 D；等電點介于6.47～9.62，除LrYABBY6和LrYABBY10之外，其余8個LrYABBY蛋白家族成員的等電點都大于7.0，說明黑果枸杞YABBY家族蛋白成員大多數富含堿性氨基酸；不穩(wěn)定系數介于26.38～70.05，除LrYABBY7，其余9個均為不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數介于55.06～81.04；親水指數介于-0.695～-0.129；總原子數介于1 584～3 294；氨基酸個數介于106～213 aa（表2）。

Expasy-ProtScale在線軟件分析黑果枸杞YABBY蛋白家族的親疏水性，結果如圖2所示，LrYABBY1最高值為2.078，在42位；最低值為-3.456，在106位；LrYABBY2最高值為1.956，在33位；最低值為-3.456，在126位；LrYABBY3最高值為2.533，在27位；最低值為-3.456，在107位；LrYABBY4最高值為2.533，在27位；最低值為-3.456，在107位；LrYABBY5最高值為2.533，在26位；最低值為-3.456，在115位；LrYABBY6最高值為1.911，在28位；最低值為-2.3，在102位；LrYABBY7最高值為2.033，在21位；最低值為-2.433，在88位；LrYABBY8最高值為1.122，在25位；最低值為-3.456，在89位；LrYABBY9最高值為2.078，在27位；最低值為-2.633，在69和70位；LrYABBY10最高值為1.911，在28位；最低值為-3，在104位。10條LrYABBY蛋白均存在明確的親疏水區(qū)域，并且親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，表明LrYABBY蛋白家族的多肽鏈均為親水性蛋白。

2.3 黑果枸杞YABBY家族的蛋白質結構和保守結構域分析

LrYABBY蛋白質二級結構預測和分析的結果中發(fā)現，10個蛋白均含有α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈。在LrYABBY家族的蛋白質中α-螺旋分布由7.41%～53.77%，β-轉角分布由1.92%～7.41%，無規(guī)則卷曲分布由35.85%～66.03%，延伸鏈分布由6.60%～32.41%，其中無規(guī)則卷曲＞α-螺旋＞延伸鏈＞β-轉角的數量最多（表3）。

LrYABBY蛋白質三級結構建模預測的分析結果顯示，LrYABBY家族的蛋白質三級結構都較為相似，如LrYABBY6和LrYABBY10等，黑果枸杞YABBY家族的10個蛋白序列中無規(guī)則卷曲均有分布且占比最大（圖3）。為后續(xù)黑果枸杞YABBY家族的蛋白質研究提供理論參考。

在黑果枸杞的10個LrYABBY蛋白序列中，有5個含有1個YABBY結構域，分別是LrYABBY1，LrYABBY2，LrYABBY3，LrYABBY8和LrYABBY9；另外5個含有1個YABBY superfamily結構域，分別是LrYABBY4，LrYABBY5，LrYABBY6，LrYABBY7和LrYABBY10。MEME在線軟件對LrYABBY家族的結果分析中，Motif1（EQLCYVPCNFCNTVLAVSVPCSSLFDIVTVRCGH-CTNLLSVNIAAAFQSH），Motif2（EKRQRVPSAYNQFIKEEIQRIKAGNPDISHREAFSTAAK-NWAHFPHIHFG），Motif3（WQNHHVQVPNYTAPEYRMDFGSSTKCNMNRMSMRTPITNNT-QQERIVNRP），Motif4（LQDLQQRQELNIEDGSRGCGSSSSSTNCHRFSPIAADDQPR）和 Motif5（YQSHQQLHQVANYTNSPHECSTRMAARPS-ITNNSPREERIV）共5個保守基序，其中含1個Motif的黑果枸杞YABBY蛋白序列有1個，含2個Motif的LrYABBY蛋白序列有8個，含3個Motif的LrYABBY蛋白序列有1個，除LrYABBY7和LrYABBY8外，其余蛋白質均含Motif1。由圖4可知，Motif1的氨基酸序列相比其他基序的保守性較高，與LrYABBY家族蛋白質結構域的保守性基本一致。

2.4 黑果枸杞YABBY家族的系統(tǒng)進化分析

為了更全面地了解黑果枸杞YABBY家族的系統(tǒng)進化關系，將黑果枸杞的10個YABBY蛋白，番茄的14個YABBY蛋白，煙草的20個YABBY蛋白和擬南芥的6個YABBY蛋白，共 50個YABBY蛋白序列構建系統(tǒng)進化樹（圖5）。根據4種植物的YABBY家族系統(tǒng)進化樹，YABBY家族成員可分為五個亞家族，黑果枸杞中YAB1/YAB3亞家族包括LrYABBY1，LrYABBY2；YAB2亞家族包括LrYABBY6，LrYABBY7，LrYABBY9，LrYABBY10；YAB5亞家族包括LrYABBY3，LrYABBY4，LrYABBY5，LrYABBY8；INO亞家族和CRC亞家族中未存在黑果枸杞YABBY家族成員。YABBY系統(tǒng)進化樹顯示其存在3個同源基因對，分別為LrYABBY3和LrYABBY4，LrYABBY5和LrYABBY8以及LrYABBY6和LrYABBY10。在YABBY家族系統(tǒng)進化樹的50個成員中，YAB1/YAB3亞家族LrYABBY2與煙草Nt016492403，Nt016477431的親緣關系最近，LrYABBY1與煙草Nt016505067的親緣關系最近；YAB2亞家族LrYABBY6，LrYABBY10與煙草Nt016461884的親緣關系最近，LrYABBY7與擬南芥At1G08456的親緣關系最近，LrYABBY9與番茄Sl001234390的親緣關系最近；YAB5亞家族LrYABBY3，LrYABBY4與煙草Nt16452662，Nt16489012的親緣關系最近，LrYABBY5，LrYABBY8與番茄Sl004242778，Sl025887658的親緣關系最近。根據以上結果，說明在3種代表物種中黑果枸杞YABBY家族與煙草YABBY家族親緣關系最近，其次是番茄。推測LrYABBY家族蛋白具有多樣性，而親緣關系較近的蛋白質可能還具有相似或相近的生物學功能。

2.5 黑果枸杞YABBY基因家族在鹽脅迫下的表達模式分析

為初步探索黑果枸杞YABBY基因的功能，分析不同濃度NaCl在不同浸泡時間的處理下，10個LrYABBY基因在根與葉的表達情況。結果表明，在鹽脅迫下，不同LrYABBY基因在不同器官中的表達量存在明顯差異，并且YABBY基因在黑果枸杞的葉中相較于根中表達更為活躍。其中葉部LrYABBY1的表達量較低，而LrYABBY8表達量較高；根部LrYABBY10的表達量較高，而LrYABBY2的表達量較低。YAB5亞族的4個成員中，LrYABBY5和LrYABBY8在高濃度（250 mmol·L-1）鹽脅迫下，1 h和12 h兩組內，葉和根中表達量均表現為上調；低濃度（50 mmol·L-1）鹽脅迫下，葉中為上調，根中為下調。LrYABBY3和LrYABBY4在高濃度鹽脅迫下，葉和根中表達量的表現與YAB5亞族另外兩個成員相同，而低濃度時則相反。在葉部中LrYABBY1，LrYABBY4，LrYABBY8，LrYABBY10在鹽處理（50 mmol·L-1和250 mmol·L-1）不同時段下表達量均高于對照組（L0），屬于受鹽脅迫誘導而上調的基因；LrYABBY6和LrYABBY9在鹽處理不同時段下表達量均低于L0，屬于受鹽脅迫誘導而下調的基因，在根部中LrYABBY10在鹽處理不同時段下表達量均高于對照組（R0），屬于受鹽脅迫誘導而上調的基因（圖6）。在濃度為50 mmol·L-1時，隨著時間的增加（1 h，12 h），根部LrYABBY1，LrYABBY2和LrYABBY6的表達量均高于對照組且呈上升趨勢；LrYABBY5和LrYABBY7的表達量均低于對照組且呈下降趨勢（圖7A）。這個濃度下1 h和12 h時，葉部LrYABBY1，LrYABBY5，LrYABBY8和LrYABBY10的表達量均高于對照組且隨時間增加而呈上升趨勢；LrYABBY9的表達量均低于對照組且隨時間的增長而呈下降趨勢（圖7B）。在濃度為250 mmol·L-1，且12 h的鹽處理下，根部LrYABBYs的表達量均高于對照組，1 h時所有成員的表達量均低于12 h的，隨著時間的延長，根部的表達量均呈現上升趨勢。根和葉的LrYABBYs在高濃度時，隨著時間的變長，LrYABBY1，LrYABBY4，LrYABBY8和LrYABBY10的表達量均在12 h時高于對照組，且隨時間的加長而呈上升趨勢；LrYABBY3，LrYABBY5和LrYABBY7的表達量隨時間的延長，FPKM由低于對照組上升至高于對照組；LrYABBY6的表達量均低于對照組且隨時間增長而呈上升趨勢，LrYABBY9與之相反（圖7）。根部LrYABBY10中，R0與R250_1差異顯著（Plt;0.05）；R0與R50_1差異極顯著（Plt;0.001）；R50_1與R250_1差異極顯著（圖7A）。葉中L0與L50_1差異顯著的基因是LrYABBY4；L0與L50_12差異顯著的是LrYABBY1；L0與L250_1差異顯著的是LrYABBY1，LrYABBY4和LrYABBY6；L0與L250_12差異顯著的是LrYABBY1，LrYABBY3和LrYABBY6；L50_12與L250_1差異顯著的是LrYABBY7；LrYABBY3的L50_12與L250_12為差異非常顯著（Plt;0.01），L250_1與L250_12差異顯著（圖7B）。綜上所述，推測它們可能在響應鹽脅迫的過程中發(fā)揮調控作用。

3 討論

通過生物信息學的方法鑒定得到10個 LrYABBY家族成員，對其理化性質、亞細胞定位、保守結構域、蛋白質結構、系統(tǒng)進化樹及表達模式進行了分析。

目前已在擬南芥［27］、水稻［28］、玉米［46］、番茄［47］、小麥［29］、煙草［30］、大白菜（Brassica rapa ssp.）［48］、蘋果（Malus pumila）［42］、人參（Panax ginseng）［44］、辣椒［31］、石榴［32］、荷花［33］、毛果楊［34］、草莓［35］、紫花苜蓿［20］、巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）［49］、北美鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）［50］和杜仲（Eucommia ulmoides）［43］等不同植物中鑒定出YABBY基因家族成員。在不同植物中的YABBY基因家族的成員數量存在差異，如擬南芥有6個YABBY基因；水稻有8個YABBY基因；玉米有13個YABBY基因；番茄有9個YABBY基因；煙草有7個YABBY基因；大白菜有11個YABBY基因；蘋果有13個YABBY基因；人參有16個YABBY基因；荷花有9個YABBY基因；毛果楊有12個YABBY基因；草莓有6個YABBY基因；巴西橡膠樹有11個YABBY基因；北美鵝掌楸有6個YABBY基因；杜仲有10個YABBY基因等，本研究共鑒定到10個黑果枸杞YABBY基因家族成員，黑果枸杞與已完成測序的植物中YABBY家族成員數量相差不大。蛋白質亞細胞定位預測中，黑果枸杞YABBY家族中多數成員定位于細胞核中，這與北美鵝掌楸［50］、人參［44］、草莓［35］、毛果楊［34］、陸地棉和海島棉［37］等植物相同。黑果枸杞的10個蛋白中有9個不穩(wěn)定蛋白和1個穩(wěn)定蛋白，且均為親水蛋白。在巴西橡膠樹［49］、杜仲［43］、荷花［33］、毛果楊［34］、蘋果［42］、人參［44］、石榴［32］、煙草［30］等植物中，它們的YABBY蛋白也均是親水蛋白，而親水性蛋白質對植物抵抗非生物脅迫有利［51］。LrYABBY蛋白家族成員的等電點多數都大于7.0，這與大部分植物YABBY蛋白家族中多數成員的理論等電點大于7.0的情況基本相一致［7，20，37，52］。保守結構域的驗證是基因家族鑒定的核心［53-54］，YABBY家族中YABBY保守結構域是發(fā)揮功能的關鍵區(qū)域，黑果枸杞與其他植物研究中此家族均含有YABBY保守結構域。通過黑果枸杞YABBY蛋白質保守基序分析中有8個成員含Motif1，這與紫花苜蓿［20］、煙草［30］、西瓜［52］、水稻［28］、石榴［32］、人參［44］、毛果楊［34］、辣椒［31］、荷花［33］、番茄［47］、陸地棉與海島棉［36-37］等均是Motif1在YABBY家族成員中占多數的情況類似。LrYABBY3和LrYABBY4聚類于YAB5亞家族的同一分支中；LrYABBY5和LrYABBY8聚類于YAB5亞家族的同一分支中；LrYABBY6和LrYABBY10聚類于YAB2亞家族的同一分支中，它們的蛋白保守結構域的組成、排列順序及位置基本相同，說明LrYABBY的分類進一步得到了保守基序的支持，也意味著其亞族成員間序列的高度保守性一致，而且親緣關系越近，蛋白質三級結構也越相似（圖3，圖4）［37］。根據其它植物YABBY家族的研究，YABBY家族可以分為5個亞族，但是黑果枸杞YABBY家族成員只在YAB1/YAB3，YAB2和YAB5，這三個亞族中有分布，另外兩個（INO和CRC）亞族中未出現LrYABBY成員，在杜仲［43］、人參［44］、番茄［47］、巴西橡膠樹［49］、北美鵝掌楸［50］等植物中也出現YABBY家族成員未均出現在五類亞族中的研究報道。所有亞族中的黑果枸杞YABBY家族成員與煙草和番茄的YABBY家族成員均相聚較近，這與黑果枸杞跟煙草和番茄進化距離相近較一致。煙草和番茄的YABBY基因順式元件分析中發(fā)現它們都有多個應答不同生物脅迫和非生物脅迫順式作用元件，說明其可能參與逆境響應，而黑果枸杞LrYABBY1和煙草Nt016505067位于同一亞族YAB1/YAB3，黑果枸杞LrYABBY9和番茄Sl001234390位于同一亞族YAB2，都在亞家族中相聚較近，通常情況下位于同一亞族的基因，其可能具有相似的功能，且LrYABBY1和LrYABBY9在鹽脅迫表達模式分析中表達量均有所波動，說明黑果枸杞YABBY家族可能參與鹽脅迫響應。以YAB5亞族為代表，黑果枸杞不同器官YABBY家族成員在高、低鹽濃度的不同時間處理下，表達量的表現有相反情況，也有相同的情況，說明黑果枸杞中同一亞族的基因，在表達模式中，既存在表達特異性，也有相似性，這與野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）［56］研究報道相似。黑果枸杞YABBY家族成員的表達量在葉中較多，根中較少，這與小麥YABBY家族成員在根中表達量偏低或不表達［29］的研究結果相似。LrYABBY8位于YAB5亞族，其在鹽脅迫下，葉部的表達量均高于其他黑果枸杞YABBY家族成員（圖5，圖6），而YAB5亞族調控植物葉的生長發(fā)育等［55］，這可能是其表達量不論在對照組（L0）或者不同濃度鹽處理（L50_1/12，L250_1/12）中都高于其他成員的原因。高鹽濃度12 h脅迫下，LrYABBY7和LrYABBY10在根和葉中的表達量均為上調，這與草莓FvYABBY2和FvYABBY5［35］的研究結果相一致。圖6根部LrYABBY家族表達模式中，R0與R250_1聚類在一起，說明對照組和短期（1 h）高濃度鹽處理組的LrYABBY家族表達模式相近，推測黑果枸杞的根部可能對這種短時間內高濃度鹽脅迫的環(huán)境變化反應較為遲鈍，根內細胞穩(wěn)態(tài)未出現較大變動，從而影響基因的表達量，這與玉米［57］YABBY家族成員在鹽脅迫中和紫花苜蓿［20］鹽脅迫的研究結果類同。圖7根中LrYABBY10的表達量在同一濃度同一時間脅迫下均高于其他LrYABBY家族成員，低濃度短期脅迫時顯著上調，長期（12 h）時下調，與高濃度相反，說明它在低鹽濃度和高鹽濃度時受到脅迫時間的長短存在不同的反應，推測它在黑果枸杞根部受不同濃度鹽脅迫時所起的調控作用可能也有所不同。葉中LrYABBY8的表達量在長期脅迫下低濃度的上調幅度大于高濃度的，而短期脅迫則是高濃度大于低濃度，說明其對低鹽濃度長期脅迫更敏感，推測其可能在黑果枸杞葉部組織受到低濃度長期鹽脅迫時起重要作用。這與其它植物YABBY家族的鹽脅迫研究有相似之處［17，19-20，35，46］。因此推測LrYABBY基因的功能可能與抗鹽脅迫相關。LrYABBY基因的鑒定與分析為進一步對黑果枸杞在鹽脅迫方面的基因研究提供理論依據，并對后續(xù)獲取黑果枸杞耐鹽轉基因植物與進一步分析此類基因的鹽脅迫應答能力提供參考基礎。

4 結論

在NaCl脅迫下的黑果枸杞轉錄組中共篩選出10個YABBY基因，分布于YAB1/YAB3，YAB2和YAB5亞家族中。蛋白質亞細胞定位預測中其家族成員主要定位于細胞核，蛋白質結構預測中10個蛋白均含有α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈，蛋白系統(tǒng)進化樹顯示在擬南芥、煙草和番茄這3種植物中，黑果枸杞YABBY家族與煙草YABBY家族親緣關系最近，其次是番茄。表達模式分析結果表明，LrYABBY10在根中高表達，LrYABBY8在葉中高表達，根和葉中 LrYABBY8 和LrYABBY10在高濃度不同時段鹽脅迫下表達量均呈現為上升趨勢，低鹽濃度短期脅迫時表達量也均高于對照組，由此推測其功能可能與抗鹽脅迫相關。本研究結果為黑果枸杞YABBY基因家族的功能鑒定及后續(xù)黑果枸杞耐鹽脅迫基因的進一步篩選提供參考。

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（責任編輯 劉婷婷）