根癌農桿菌介導的紫花苜蓿遺傳轉化體系的優化

摘要：為進一步提高根癌農桿菌介導的紫花苜蓿遺傳轉化效率，本試驗以紫花苜蓿（Medicago sativa L.）品種‘中苜1號’為試驗材料，通過篩選高效再生的植株，以篩選出的植株葉片為外植體，并通過調節培養基激素配比，在農桿菌侵染過程中添加谷氨酰胺、進行冷處理等措施優化苜蓿由農桿菌介導的遺傳轉化體系。試驗結果表明：轉化過程中以嫩葉作為外植體，菌液和重懸液中添加150 μmol·L-1乙酰丁香酮，侵染過程中使用300 μmol·L-1的谷氨酰胺將瞬時轉化效率從32%提高至92%，轉化效率提高到31%。研究紫花苜蓿的遺傳轉化體系可為紫花苜蓿高效遺傳改良及基因功能研究提供了技術支持。

關鍵詞：紫花苜蓿；根癌農桿菌；遺傳轉化；體系優化

中圖分類號：Q756"" "文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）06-1665-07

Optimization of Agrobacterium Tumefaciens-Mediated Genetic

Transformation System of Alfalfa

WANG Zhi-jie， LI Ming-xu， ZHANG Wan-jun*

（College of Grassland Science and Technology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Abstract：In order to improve Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation efficiency of alfalfa （Medicago sativa L.），we used alfalfa variety ‘Zhongmu No.1’ as plant material. The genetic transformation system of alfalfa mediated by agrobacterium was optimized by selecting the highly regeneration plant，using young leaves as explants，adjusting the hormone ratio in the medium，adding glutamine，and giving a cold treatment during agrobacterium infection. The results showed that the transient transformation efficiency of ‘Zhongmu No.1’ increased from 32% to 92% and the stable transformation efficiency increased to 31% by adding 150 μmol·L-1 acetosyringone to the bacterial suspensions solution，and using 300 μmol·L-1 glutamine during infection. The genetic transformation system of alfalfa reported in this paper provides technical support for efficient genetic improvement and gene functional study of alfalfa.

Key words：Alfalfa;Agrobacterium tumefaciens;Genetic transformation;System optimization

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一種多年生的豆科牧草，因其粗蛋白含量高、適口性好、生長迅速等優點，被譽為“牧草皇后”。目前，我國的苜蓿干草和種子仍大量依靠進口［1］，亟需培育出高產、優質、有自主知識產權的新品種。紫花苜蓿是同源多倍體，具有自交不親和的遺傳特性。目前，國內現有品種均是通過傳統育種方式育成，周期長、效率低。近年來，隨著基因工程育種技術的不斷發展，使得快速、定向獲得優質新種質材料成為了可能。而遺傳轉化技術是現代基因工程育種的底盤技術，因此，建立快速、高效的紫花苜蓿遺傳轉化體系是加速優質苜蓿育種進程的首要前提。

Deak等［2］首次使用農桿菌轉化法成功轉化紫花苜蓿后，多位研究者通過對培養基配方、外源激素配比、最適農桿菌菌株等進行了詳細的調查，發現大部分苜蓿品種在侵染過程中使用EHA105農桿菌菌株侵染效果較好，在添加一定濃度的2，4-D、6-BA、KT的MS基本培養基上，愈傷誘導率及再分化率較高［3-5］，但是目前國內大部分苜蓿品種轉化效率仍不足10%［6-8］?！熊?號’是我國重要栽培品種，抗逆性狀優良［9］，是紫花苜?；蚬こ逃N的優質底盤材料，但目前‘中苜1號’遺傳轉化體系的轉化效率較低［8］，限制了應用該品種開展分子育種方面的研究。為此，需對其遺傳轉化流程進行優化，建立高效、穩定的遺傳轉化體系。

紫花苜蓿遺傳轉化體系都以幼苗的子葉或下胚軸作為外植體，但由于紫花苜蓿具有異花授粉的特性，其品種內部任何兩粒種子的基因型都可能不一致，影響對紫花苜?；蚬δ艿难芯俊Ｒ虼?，本試驗以篩選獲得的‘中苜1號’高再生植株葉片為外植體，選擇適宜的潮霉素篩選濃度，探究不同類型葉片外植體、添加乙酰丁香酮（AS）、添加谷氨酰胺（Gln）及冷處理對轉化效率的影響，優化了‘中苜1號’的遺傳轉化體系，為紫花苜蓿的遺傳改良和基因功能研究提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以紫花苜蓿品種‘中苜1號’的葉片（如圖2B所示）、子葉和下胚軸（如圖1B所示）作為外植體。

試驗農桿菌為含有pCAMBIA1305.1質粒的EHA105，T-DNA區包括由煙草花葉病毒35S啟動子控制下的潮霉素篩選標記基因及GUS報告基因。

1.2 試驗方法

1.2.1 篩選高效再生材料 選取萌發7天‘中苜1號’無菌苗的子葉和下胚軸為外植體，切為小塊，置于D+K培養基上，組培室條件下（26℃，16 h，5 000 Lux光照/ 8 h黑暗）進行脫分化誘導，培養2周后挑選愈傷組織于DK培養基上誘導體細胞胚，挑選魚雷型胚狀體移入MSK培養基上誘導芽再生，每兩周繼代1次，繼代1～2次后轉移至生根培養基上培養至根系形成以獲得高再生的植株。體細胞發生率高，胚狀體容易成苗的再生苗被看作是容易再生的苜蓿植株。

1.2.2 潮霉素篩選條件優化 以前期篩選出的高再生植株葉片作為外植體，0.1%次氯酸鈉溶液消毒葉片5 min，無菌水沖洗6～8次后使用無菌解剖刀切為0.25 cm2左右大小的方形小塊（如圖3A所示），實驗組外植體置于添加5 mg·L-1 潮霉素（Hygromycin B，Hyg）的BD培養基光下培養，對照實驗組不添加潮霉素。將培養14天后的實驗組外植體分別放置于含有5，10，15，20 mg·L-1濃度梯度潮霉素的D+K培養基，對照實驗組置于不含潮霉素的D+K培養基，每個處理20片外植體，每2周繼代一次并統計正常狀態愈傷比例，重復3次。

1.2.3 添加AS濃度的優化 在菌液、重懸液、共培養基中分別添加50，100，150 μmol·L-1 AS進行轉化（重懸液及共培養基需在滅菌后加入），具體操作為：菌液搖培至OD600≈0.5，分別加入50，100，150 μmol·L-1 AS，繼續培養菌液至OD600≈0.8，5 000 r·min-1 離心5 min收集菌體，用重懸液重懸至OD600為0.2～0.4，28℃放置2 h，制備為侵染液。

1.2.4 最佳外植體選擇的優化 以刈割后新長出枝條頂端的第1，2片葉（嫩葉）、第3到5片葉（成熟葉）、莖基部葉（老葉）為外植體，0.1%次氯酸鈉溶液消毒葉片5 min，無菌水沖洗6～8次后切為0.25 cm2左右大小的方形小塊進行侵染，重復3次。

1.2.5 侵染流程的優化 以相同數目的外植體分別采用不同處理方式探究侵染流程中添加谷氨酰胺，冷處理對侵染效率和轉化效率的影響，每種處理方式具體操作為：

CK：外植體侵染前不進行處理，浸入侵染液真空處理2 min（-0.08 Mp）。

G：外植體在含有300 μmol·L-1的Gln 的3%蔗糖溶液中室溫浸泡20 min，浸入含有300 μmol·L-1的Gln在侵染液中，真空處理2 min（-0.08 Mp）。

CG：外植體放于預冷的含有300 μmol·L-1Gln的3%蔗糖溶液中，置于冰盒中冰浴20 min，后浸入含有300 μmol·L-1的Gln在侵染液中，真空處理2 min（-0.08 Mp）。

經上述方式處理后的外植體置于80 rpm·min-1 28℃條件下搖培侵染20 min，將侵染后的葉片在超凈臺中晾干，置于加蓋有1層無菌濾紙的共培養基中，暗處共培養3天。實驗重復2次。

1.2.6 篩選和分化培養 共培養3天后的外植體移入BD培養基（添加5 mg·L-1潮霉素、100 mg·L-1 特美汀、200 mg·L-1頭孢噻肟鈉），組培室條件下培養。2周后，將外植體分成小塊，置于D+K培養基（添加10 mg·L-1潮霉素、100 mg·L-1 特美汀、200 mg·L-1頭孢噻肟鈉），每2周繼代1次，誘導產生愈傷組織。挑選生長旺盛的白色愈傷組織（抗性愈傷，如圖4 F所示）置于DK培養基（添加10 mg·L-1潮霉素、100 mg·L-1 特美汀、200 mg·L-1頭孢噻肟鈉）誘導體細胞胚發生，挑選魚雷型胚狀體置于MSK培養基（添加10 mg·L-1潮霉素、100 mg·L-1 特美汀、200 mg·L-1頭孢噻肟鈉）培養14天進行芽再生，隨后轉至生根培養基直至幼芽生長為再生幼苗。

1.2.7 GUS基因表達檢測及指標統計 使用GUS染色試劑盒進行檢測（購于北京酷來博科技有限公司，產品貨號SL7160）。分別選取外植體（共培養3天）、胚狀體和幼苗的葉片進行染色。將待染色的組織浸泡在GUS染色液中，真空處理10 min（-0.08 Mp），37℃暗處染色過夜，75%乙醇溶液脫色至未表達部位呈白色（NiKon SMZ25體視顯微鏡拍攝）。通過GUS的表達情況統計以下數據，瞬時轉化效率=含有藍色組織的外植體數/染色總數，植株陽性率=顯色為藍色的植株數（陽性植株）/染色的植株總數，轉化效率=含有GUS基因表達植株的株系數/轉化的總外植體數。

2 結果與分析

2.1 篩選高效再生遺傳背景材料

‘中苜1號’紫花苜蓿的子葉和下胚軸經過脫分化、體細胞胚誘導、芽再生及生根培養后，從不同遺傳背景的愈傷組織中，篩選體細胞發生頻率高的愈傷組織上再生的植株，用于后續的遺傳轉化。

2.2 篩選培養潮霉素濃度

脫分化誘導培養14天后，將外植體置于含有不同濃度潮霉素的D+K培養基中培養4周，每2周生長旺盛狀態愈傷的比例，隨著潮霉素濃度的升高，愈傷組織的褐化速度不斷加快，潮霉素濃度高于10 mg·L-1條件下，培養2周時愈傷組織的生長會明顯受到抑制，并且4周時90%以上的愈傷組織褐化，無法再分化出胚狀體，但是15，20 mg·L-1的潮霉素在2周時會使愈傷嚴重褐化，生長抑制嚴重（圖2）。因此，在后續的遺傳轉化過程中，選擇10 mg·L-1潮霉素用于篩選抗性愈傷。

2.3 苜蓿嫩葉的轉化效率高

外植體是影響轉化效率的一個重要因素，試驗選定了不同部位的葉片作為轉化受體，根據生長位置差異分類，通過GUS染色，測定農桿菌對不同類型外植體的侵染能力，結果顯示：3種類型的葉片中，只有嫩葉和成熟葉中檢測到GUS基因的表達，老葉中未檢測到GUS基因的表達，其中嫩葉的農桿菌侵染率相比成熟葉片高20%，并且培養2周后，嫩葉脫分化狀況最好，所以后續實驗中選擇莖頂端新生的葉片為外植體進行轉化體系的優化。

2.4 添加150 μmol·L-1AS轉化效率高

侵染液和共培養基中分別加入不同濃度的AS進行轉化。篩選培養后，統計抗性愈傷（HygR愈傷，生長旺盛的白色愈傷）比例，再分化率和幼芽陽性率，結果如表3所示：添加50，100，150 μmol·L-1AS的抗性愈傷比例、再分化率和幼芽GUS陽性率依次增加。AS-150下，再分化率和幼芽GUS陽性率分別達20.95%和19.80%，高于AS-50和AS-100。說明加入150 μmol·L-1的AS能顯著提高轉化效率。

2.5 侵染時添加谷氨酰胺有利于轉化

本試驗共設置3種處理方式，統計分析瞬時轉化效率和轉化效率，3種處理方式中，G處理轉化效率最高，瞬時轉化效率為92.35%，轉化效率為31.56%，因此添加Gln能夠顯著提高農桿菌的侵染效率（表4）。

3 討論

基因型是影響轉化效率的重要因素，紫花苜蓿的體外再生能力具有很強的基因型依賴性［10］，不同品種間及同一品種內不同植株間的再生效率差異巨大，選擇高頻再生的基因型是高效遺傳轉化體系建立的前提［11］。多位學者通過對不同類型外植體組織培養發現不同外植體的再生效率差異顯著［12-14］，王強龍等［15］比較了紫花苜蓿的下胚軸、子葉、葉片和葉柄的再生能力，發現下胚軸是一種理想的受體材料，并以下胚軸作為外植體建立了紫花苜蓿的遺傳轉化體系。雖然下胚軸再生能力較強，但轉化效率仍極低，且不能排除基因型的影響，難以進行基因的研究。相比之下，以高再生基因型的植株葉片作為轉化受體，材料易獲得，遺傳背景一致，在應用方面有更好的前景。但不同生長部位的葉片再生和轉化效率差異較大，大多數植物的幼嫩組織部位的再生及轉化效果更好，與本實驗結果一致，后續探究其他品種紫花苜蓿遺傳轉化體系時，可優先采用幼嫩組織為外植體以提高轉化效率。

本研究所用的雙元載體pCAMBIA1305.1的T-DAN區含有抗潮霉素的篩選標記基因，遺傳轉化實驗中用抗生素潮霉素B來篩選轉基因抗性再生苗。添加篩選劑是遺傳轉化過程中從大量細胞或組織中篩選出轉化細胞及陽性植株的有效手段［16］，篩選劑濃度會對遺傳轉化效率產生影響。較低濃度的篩選劑無法有效篩選轉化細胞，過高濃度的篩選劑會導致未整合表達篩選標記基因的轉化細胞受到損傷，降低轉化體系的效率。因此，選擇合適的篩選劑添加濃度對遺傳轉化體系的優化尤為重要。潮霉素B具有篩選效果顯著﹑不同基因型間篩選效果差異小等優點而被廣泛使用。苜蓿不同品種及同一品種的不同部位對潮霉素的敏感度存在差異，如苜蓿遺傳轉化體系中潮霉素的適宜濃度范圍是10～50 mg·L-1，保定苜蓿的遺傳轉化體系采用30 mg·L-1潮霉素作為愈傷誘導及分化階段的篩選濃度，‘西南1號’紫花苜蓿葉片遺傳轉化體系的篩選濃度適合設定為10 mg·L-1潮霉素［17-19］。因此，在優化體系前測定外植體對篩選劑的敏感度，選擇一個能夠抑制絕大多數未轉化細胞的篩選劑濃度十分重要。

侵染流程是轉化方案中最為核心的部分［11］，優化外植體選擇后，還可以通過優化侵染流程進一步提高轉化效率。在轉化過程中，葉片的造傷程度、農桿菌活性、植物細胞在農桿菌侵染過程中產生的抗病性防御反應等都會影響轉化效率。AS是雙子葉植物細胞壁合成的前體物質，它能使農桿菌趨化性感染宿主植物受傷部位，誘導農桿菌Vir區基因的表達，促進T-DNA的加工與轉移，從而使農桿菌的T-DNA進入并整合進植物基因組。農桿菌Ti或Ri質粒的Vir區編碼產物負責接收外界信號，具有T-DNA的加工、轉移及整合等功能，對菌種的侵染力起決定性作用［20］。在侵染過程中添加AS能顯著提高大豆［21］、紫花苜蓿［22］的遺傳轉化效率，但不同物種、植株間最適添加量不盡相同，本研究通過比較不同濃度AS對轉化效率的影響，確定150 μmol·L-1的AS對篩選所得高再生材料的遺傳轉化有促進作用。Gln作為植物主要的氮轉運化合物，與植物的抗病性防御反應有關，添加Gln可通過衰減某些病理相關基因改善土壤農桿菌介導的植物轉化效率［23］。Zhang等［24-25］在侵染時添加了Gln，成功降低了植物組織產生的抗病性防御反應，顯著提高了黑麥草和柳枝稷的轉化效率。趙振軍等［26］通過添加Gln提高了棉花下胚軸的遺傳轉化效率。本研究比較了3種侵染流程下的‘中苜1號’轉化效率，發現在轉化過程中添加150 μmol·L-1AS和300 μmol·L-1Gln中可以有效的提高轉化效率。

4 結論

本研究篩選了‘中苜1號’高再生植株，測定潮霉素篩選濃度為10 mg·L-1，探究轉化的侵染條件為：以莖頂端嫩葉為外植體，菌液和重懸液中添加150 μmol·L-1的AS，侵染時添加300 μmol·L-1的Gln，浸入侵染液中真空處理2 min（-0.08 Mp），搖培侵染20 min，晾干后共培養3天。瞬時轉化效率可達92%，轉化效率提高至31%，建立了一種高效、穩定遺傳轉化體系，為該品種的遺傳改良和紫花苜蓿的轉化方法提供了技術基礎和參考。

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（責任編輯 彭露茜）