基于CP基因的云南煙草花葉病毒RT-LAMP快速檢測體系的構建

關鍵詞：煙草花葉病毒；CP基因；RT-LAMP；特異性；靈敏度

煙草花葉病毒（Tobacco mosaLc VLrUS，TMV）是目前云南煙草生產中發(fā)生最普遍、分布最廣的病毒，屬帚狀病毒科（ Vigaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），可以通過機械接種、嫁接、植物之間的接觸和種子傳播，但不能通過任何已知的媒介傳播。目前，已報道TMV可侵染莧科、藜科、菊科、十字花科、茄科等38科300余種植物。TMV侵染作物后，會破壞葉綠素，使光合作用減弱，造成植物生長困難、發(fā)育不良，葉片厚薄不均、葉緣向下卷曲、明脈、矮化、花葉、斑駁、黃化畸形甚至整株死亡。TMV很難防控，對煙草、番茄、黃瓜和蘭花等多種經濟作物及花卉等觀賞植物造成嚴重損失，目前的主要防治措施為培育抗病品種和選種無毒健苗。

TMV感染初期癥狀不明顯，且常與黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaLc VLrUS，CMV）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus y，PVY）等病毒混合侵染，田間發(fā)病癥狀相似，病原診斷困難。傳統(tǒng)的煙草病毒病診斷方法包括培養(yǎng)、電鏡觀察、免疫學和分子生物學技術等，但這些方法通常具檢測效率低、需要專業(yè)設備、樣品制備耗時長、對實驗操作要求嚴格等缺點，大大限制了其在實際生產中的推廣應用。環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）于2000年由日本學者Notomi等發(fā)明，針對靶基因的6個區(qū)域設計6條特異引物，結合DNA鏈置換聚合酶（BstDNA polymerase）使模板兩端引物結合部位循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結構，由此使得引物在恒溫條件下可以與靶基因結合發(fā)生鏈置換完成擴增反應。在LAMP擴增產物中加入熒光染料可直接觀察結果，節(jié)省了常規(guī)PCR反復升降溫度的時間，具有檢測速度快、靈敏度高、不需要專業(yè)設備的優(yōu)點，已被廣泛應用于新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）、香蕉苞片花葉病毒（Banana bract mo-saLc VLrUS，BBrMV）等的檢測。

TMV基因組為正義單鏈ssRNA，長6395bp，至少編碼4個蛋白，其中外殼蛋白（coat protein，CP）參與癥狀誘導，對病毒的遠距離運動至關重要。CP基因序列保守性較高，常被應用于TMV檢測技術的開發(fā)。Zhao等研究表明．RT-LAMP體系因擴增的特異性位點不同可對株系進行區(qū)分。因此，已報道的基于其他地區(qū)TMV建立的RT-LAMP體系不一定能較好地擴增云南煙草TMV。目前，已報道的有基于陜西煙草、山東煙草、青島煙草TMV的RT-LAMP檢測方法，但是檢測時間都較長且不確定是否適用于云南煙草TMV的檢測。

本研究評估了已報道的3種RT-LAMP檢測體系對于云南煙草TMV的檢測效率，然后基于云南煙草TMV分離物的CP基因保守序列設計5組引物進行篩選，對反應體系各組分進行逐一優(yōu)化，并通過特異性、靈敏度檢測等對其效果進行評估，以期建立適用于云南煙草TMV的RT-LAMP檢測體系，為TMV早期快速診斷及防治提供技術支持。

1材料與方法

1.1病毒樣品

本研究中使用的煙草花葉病毒、馬鈴薯Y病毒、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spot vi-rus，TZSV）、南美紅辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinalmottle virus，ChiVMV）、番茄褐色皺紋果病毒（To-mato brown rugose fruit virus．ToBRFV）、黃瓜花葉病毒、煙草脈帶花葉病毒（Tobacco veLn bandingmosaLc VLrUS，TVBMV）、朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspotvirus，HCRV）等，均由云南省高校作物種質創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點實驗室純化保存后接種于本氏煙，樣本經RT-PCR檢測確認含有單一病毒后，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ允覝厣L的健康脫毒煙草為陰性對照。

1.2主要試劑

TRNzol Universal總RNA提取試劑購自天根科技（北京）有限公司；MgS04（100mmol/L）、WarmStart通用LAMP/RT-LAMP 2x預混液、Bst2.0DNA聚合酶購自美國New England Biolabs公司；Uracil-DNA Glycosylase購自上海碧云天生物技術有限公司；M-MLV逆轉錄酶購自Promege公司；甜菜堿、熒光指示劑SYBR Green I購自北京索萊寶科技有限公司；dNTPs（10 mmol/L）購自上海CWBIO公司；HiScriptⅡlst strand cDNA Syn-thesis Kit反轉錄試劑購自江蘇Vazyme公司。

1.3引物設計

在GenBank數(shù)據(jù)庫中挑選來自云南煙草的TMV分離物CP基因（登錄號：KC572633），將其保守區(qū)域作為引物設計的參考序列，通過在線軟件Primer Explorer V5（http：//primerexplorer. jp/e/）設計5組RT-LAMP引物和1組RT-PCR引物（表1）。其中，F(xiàn)3和B3為外引物，F(xiàn)IP和BIP為內引物；LF/LB為環(huán)引物。RT-PCR引物目的片段大小為570bp。所有引物均用PAGE法純化，委托生工生物工程（成都）有限公司合成。

1.4RNA提取

參照TRNzol Universal總RNA提取試劑說明書提取新鮮煙草葉片總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的質量，-80℃保存?zhèn)溆谩?.5RT-PCR檢測及已報道的RT-LAMP體系驗證

以總RNA為模板，采用PrimeScriptrrMⅡlststrand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒合成cD-NA。以等體積cDNA為模板，利用TMV - F/R引物進行RT-PCR擴增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物質量。使用Zhao等、Liu等、張俊建立的TMV RT-LAMP體系檢測上述RT-PCR產物，評估其對云南煙草TMV的適用性。

1.6RT-LAMP引物篩選

參照Bst 2.0 Warm StartDNA Polymerase說明書，用1.3中的5組RT-LAMP引物對TMV進行擴增。反應體系如下。每組分別以健康脫毒煙草的RNA為陰性對照，62℃恒溫擴增60min。擴增產物加1000xSYBRGreen 1uL進行染色，熒光綠為陽性，橙黃色為陰性。取擴增產物4uL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，梯狀條帶為陽性，無條帶為陰性。篩選出一組擴增效率高且不出現(xiàn)假陽性的引物進行反應體系優(yōu)化。

1.7RT-LAMP體系優(yōu)化

為確定最佳擴增條件，采用單一變量法，每個條件設3次重復，對RT-LAMP體系各條件進行逐一優(yōu)化。每個變量分別設置梯度試驗：反應溫度58、60、62、64、66、68℃；反應時間20、30、40、50、60、70min;甜菜堿濃度0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/L; dNTPs濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L；Mg2+濃度0、2、4、6、8、10mmol/L;內、外引物濃度比1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1。每個梯度分別以健康脫毒煙草的RNA為陰性對照，反應結束后取擴增產物4uL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8RT-LAMP與RT-PCR靈敏度比較

在最佳反應條件下，將云南煙草TMV的總RNA 10倍梯度稀釋（100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），以稀釋后的RNA作為RT -LAMP和RT-PCR的模板，進行靈敏度比較測試。SYBR Green I染色和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.9RT-LAMP特異性檢驗

在最佳反應條件下，以9種煙草常見病毒：TMV、PVY、TSWV、TZSV、ChiMV、ToBRFV、CMV、TVBMV、HCRV的RNA為模板，分析檢測交叉反應性，以評估所建立RT-LAMP體系的特異性，SYBR Green I染色和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

2結果與分析

2.1RT-PCR檢測及已報道的RT-LAMP體系驗證

使用TMV-F/R引物檢測云南煙草TMV（圖IA），結果顯示，TMV樣品擴增出相關DNA片段，電泳檢測結果與目的片段大小（570bp）-致且無雜帶；而陽性對照未擴增到目標條帶。表明樣品被TMV侵染，而陰性對照未被TMV侵染，可進行后續(xù)試驗。

分別使用Zhao等、Liu等、張俊建立的TMV RT-LAMP體系檢測云南煙草TMV分離物，結果（圖1B）顯示，Liu等的體系對樣品有少量擴增，陰性對照未擴增；Zhao等和張俊的體系陰性對照和樣品均未擴增。表明這3種體系對云南煙草TMV樣品的檢測效率均不高，有必要建立適用于云南煙草的TMV RT-LAMP檢測體系。

2.2引物篩選

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖2A），第1～4組引物均擴增出梯狀條帶且未出現(xiàn)假陽性，第4組引物條帶最亮：第5組引物擴增出較弱條帶且陰性對照未出現(xiàn)假陽性。熒光檢測與凝膠電泳檢測結果一致（圖2B）。選定第4組引物為最佳引物以進行反應條件優(yōu)化。

2.3反應條件優(yōu)化

2.3.1反應時間優(yōu)化用第4組引物擴增時，反應20～30min未擴增出條帶．40min開始出現(xiàn)明亮的梯狀條帶（圖3A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結果一致（圖3B），陰性對照均未出現(xiàn)假陽性。結合高效性考慮，選擇最佳反應時間為40 min。2.3.2反應溫度優(yōu)化反應溫度優(yōu)化結果（圖4）表明，擴增溫度為58～68℃時均有梯狀條帶產生，陰性對照均未出現(xiàn)假陽性。但溫度為58。C時梯狀條帶較淡，60～68℃時梯狀條帶較明亮，熒光檢測與凝膠電泳檢測結果一致。結合實用性考慮，選擇最佳反應溫度為60℃。

2.3.3甜菜堿濃度優(yōu)化甜菜堿濃度優(yōu)化結果（圖5）表明，甜菜堿濃度為0時幾乎沒有梯狀條帶，0.6～1.6mmol/L均有梯狀條帶，1.6mmol/L時梯狀條帶最亮，陰性對照均未出現(xiàn)假陽性，熒光檢測與凝膠電泳檢測結果一致。結合降低檢測成本考慮，選擇最佳甜菜堿濃度為0.6mmol/L。

2.3.4dNTPs濃度優(yōu)化dNTPs濃度優(yōu)化結果（圖6）表明，dNTPs濃度為0時沒有梯狀條帶產生，從0.2～0.4mmol/L梯狀條帶較為明亮，0.6mmol/L開始梯狀條帶逐漸減弱，陰性對照均未出現(xiàn)假陽性，熒光檢測與凝膠電泳檢測結果一致。結合降低檢測成本考慮，選擇最佳dNTPs濃度為0.4mmol/L。

2.3.5Mg2+濃度優(yōu)化Mg2+濃度優(yōu)化結果（圖7）表明，Mg2+濃度為0時沒有梯狀條帶產生，2～8mmol/L梯狀條帶亮度逐漸增強，陰性對照均未出現(xiàn)假陽性，熒光檢測與凝膠電泳檢測結果一致。結合降低檢測成本及避免假陽性考慮，選擇最佳Mg2+濃度為2mmol/L。

2.3.6內、外引物濃度比優(yōu)化內、外引物濃度比優(yōu)化結果（圖8）表明，內、外引物濃度比為1：1～4：1時梯狀條帶亮度逐漸增強，4：1～8：1梯狀條帶亮度趨于穩(wěn)定，陰性對照均未出現(xiàn)假陽性，熒光檢測與凝膠電泳檢測結果一致。結合降低檢測成本考慮，選擇最佳內、外引物濃度比為4：1。

2.4靈敏度檢測

靈敏度檢測結果表明，稀釋倍數(shù)為10～10-6時，RT-LAMP可以擴增出梯狀條帶，隨著稀釋倍數(shù)的增加，條帶變弱，10-7時梯狀條帶消失．即RT-LAMP的檢測限為10-6（圖9A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結果一致（圖9B）。而RT-PCR在10～10-5時，隨著稀釋倍數(shù)的增加，條帶變弱，10-6時條帶消失，即RT-PCR的檢測限為10-5（圖9C）。因此，本研究建立的RT-LAMP檢測體系靈敏度為傳統(tǒng)的RT-PCR方法的10倍。

2.5特異性檢測

特異性檢測結果（圖10）表明，該RT-LAMP體系從云南煙草TMV中擴增出梯狀條帶，而在其他病毒（PVY、TSWV、TZSV、ChiVMV、ToBRFV、CMV、TVBMV、HCRV）及陰性對照中均未擴增出條帶，熒光檢測與凝膠電泳檢測結果一致。表明建立的RT-LAMP體系具有良好的特異性。

3討論與結論

煙草是云南經濟的支柱產業(yè)，然而由TMV引起的煙草花葉病在云南煙草種植區(qū)廣泛發(fā)生，嚴重影響煙草的產量及品質。篩選無毒健苗是目前防治TMV的有效方法之一，然而TMV傳播速度極快，早期無明顯癥狀，且易與其他病毒發(fā)生復合侵染，田間癥狀十分復雜，給煙草病害的防治帶來諸多困難，嚴重制約了煙草產業(yè)的發(fā)展。目前已有的檢測方法不適用于實際生產中TMV的快速、準確、簡便檢測，急需建立適用于云南煙草TMV的快速檢測技術以支持煙苗檢疫。LAMP檢測技術成本低、靈敏度高、操作簡單，反應結果肉眼就可判斷，特別適合基層機構應用。本研究建立了針對云南煙草TMV的RT-LAMP檢測體系，僅需60℃恒溫反應40min即可通過熒光顯色劑直接觀察結果，無需借助復雜儀器設備，不與其他煙草常見病毒發(fā)生交叉反應，靈敏度是常規(guī)RT-PCR的10倍，檢測成本低，檢測效率高，適合基層單位對大量樣品進行煙草TMV檢測。

植物病毒株系具有多樣性，準確檢測病毒株系是許多研究的必要條件。由于RT-LAMP反應時，6個區(qū)域都被4個引物匹配才可以進行擴增，所以該方法特異性較高，具備區(qū)分株系的能力。Zhao等根據(jù)PVY-0的CP基因設計了特異引物，并使用PrimerExplorer V4軟件確定他們不能識別其他PVY-N、N-Wi和NTN株系，間接證明了RT-LAMP能夠實現(xiàn)對TMV株系的鑒定。TMV分布范圍廣，不同地域間的株系有很大差異。煙草上的株系主要有TMV-OM、TMV-U1、TMV-Vulgare、TMVRS、TMVC、TMVN、TMVY，云南煙草TMV主要屬于TMV-U1株系．山東煙草TMV主要屬于TMVC、TMVN、TMVY、TMVSR株系，陜西煙草TMV的優(yōu)勢株系尚未見報道。Liu等、Zhao等、張俊分別建立了針對山東煙草、陜西煙草和青島煙草TMV的RT-LAMP檢測體系，有必要建立適用于云南煙草的RT -LAMP檢測體系。

Nagamine等的研究顯示，在4條引物的基礎上設計出環(huán)引物，使之與莖環(huán)和鏈置換DNA雜交，可將反應時間從1.0～1.5h縮短至30min左右：呂沁風等在建立惡性瘧原蟲的LAMP體系過程中發(fā)現(xiàn)，在普通加環(huán)引物檢測的基礎上，加入第2對環(huán)引物可將檢測時間縮短10min;謝學文等在茄匍柄霉的LAMP體系中加入環(huán)引物使反應時間縮短至27min。Zhao等、Liu等、張俊建立的TMV RT-LAMP檢測體系檢測時間都是60min，且Liu等、Zhao等并未添加環(huán)引物。本研究建立的云南煙草TMV的RT-LAMP檢測體系添加了1對環(huán)引物，將反應時間縮短至40min，在保證體系穩(wěn)定的基礎上提升了田間TMV病樣的檢測效率。

綜上所述，本研究針對云南煙草建立并優(yōu)化了TMV的RT-LAMP檢測體系，進一步完善了檢測不同株系TMV的RT-LAMP檢測方法，檢測結果更加準確。該方法設備成本低、快速簡便、靈敏度高、特異性強，可用于試劑盒開發(fā)，為田間樣品及無毒煙苗的檢測和生產提供技術支持。