棉花黃萎病生防菌篩選鑒定及根瘤菌DG3-1對棉花生長的影響

關鍵詞：棉花：內生細菌：棉花黃萎病：拈抗：根瘤菌DG3-1：促生

新疆是我國棉花的主要產區之一，也是我國棉花產量的重要來源，棉花作為最主要的經濟作物已成為新疆經濟發展不可缺少的一部分。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的土傳真菌性病害，隨著連作年限的延長，棉花黃萎病發生也在不斷加劇，嚴重影響了棉花產量和品質，已成為限制新疆棉花產業發展的重要因素。目前，輪作倒茬、抗病品種選育以及化學防治等是防治棉花黃萎病的主要措施。但棉花黃萎病菌能產生微菌核，而輪作并不能減少土壤中微菌核的數量，且抗病品種不易獲得，化學農藥雖然在一定程度上可以減輕棉花黃萎病的危害，但其對生態的影響不容忽視。

利用內生細菌防治棉花黃萎病已成為當前研究的熱點。內生細菌廣泛定殖于棉株各組織的細胞內或細胞間隙，并與植株建立了穩定的互利共生關系。目前利用內生細菌防治棉花黃萎病已有較多報道，周京龍等從健康棉株中分離得到一株蠟樣芽胞桿菌YUPP-10，能夠有效抑制棉花黃萎病的發生；Zabihullah Sherzad等從棉花根系中分離得到一株解淀粉芽孢桿菌，利用其發酵液浸泡種子，對棉花黃萎病的防治效果達到54.99%：金利容等從棉花莖部分離篩選出一株內生細菌HB3S-20，對棉花黃萎病菌的平板抑制率達到47.30%，溫室防控效果達到60%以上。

分離篩選新型、高效的拮抗菌株是生物防治的基礎。本研究以南疆本地種植的健康棉花為研究對象，從不同組織中分離篩選對棉花黃萎病菌有良好拮抗效果的棉花內生細菌，選取一株拮抗效果較好的根瘤菌DG3-1制備菌懸液，利用盆栽試驗測定其對棉花生長的影響，以期為棉花內生菌的開發利用提供菌種資源，為微生物肥料以及微生物菌劑的研發和應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

棉株：分別于2019年6月、2020年5月采自新疆阿拉爾市農業科學研究所試驗站，品種為新陸中70。

供試病原菌：大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb）由塔里木大學植物保護專業病理實驗室提供。

培養基：NA培養基：1L水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15g，pH值7.3+0.1；LB培養基：1L水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、瓊脂粉15g、氯化鈉10g，自然pH值；PDA培養基：1L水中加入馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15v，自然pH值。

主要試劑：Taq Master Mix、ddH2O、細菌16SrDNA通用引物27F/1492R、瓊脂糖等均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2棉花內生細菌的分離與保存

采用平皿組織分離法分離棉花不同組織的內生細菌。將根、莖分別切成3～5cm小段，葉切成3x3cm2左右方塊；75%（體積分數）乙醇溶液浸泡30s，滅菌水沖洗2～3次，用3%（質量分數）NaClO溶液浸泡2～3min，滅菌水沖洗2～3次：然后將根和莖切成0.5cm左右的小段，葉片剪成0.5X0.5cm2的組織塊，用無菌手術刀將根、莖縱剖成兩半，剖面朝培養基放置；取最后一次洗滌滅菌水涂布于NA培養基作為對照，以確定棉株組織消毒是否徹底。將處理好的組織樣品分別按每皿5塊接種于NA培養基，重復3次，27℃培養，12h觀察一次；菌落長出后，采用平板劃線法對菌株進行純化，黑暗條件下30℃培養12h：使用無菌接種環挑取單菌落接種于液體LB培養基，30℃、180r/min恒溫搖床培養16h，吸取800uL菌液加入裝有800uL滅菌甘油（濃度50%）的2mL離心管中混勻，置于-80℃冰箱保存。

1.3棉花黃萎病拮抗細菌的篩選

采用平板對峙法，用無菌接種環挑取大麗輪枝菌菌絲接于PDA培養基正中央：在距離中心30mm相互垂直的四個方向，接種2uL供試細菌發酵液，靜置10～20min，黑暗條件下27℃恒溫倒置培養，以無菌水為對照：7d后觀察是否有抑菌圈產生，測量并記錄病原菌菌落直徑。內生細菌對病原真菌的相對抑菌率（%）=（對照組病原真菌直徑一試驗組病原真菌直徑）／對照組病原真菌直徑×100。相對抑菌率超過35%認為有抑菌作用，超過50%認為是優勢內生拮抗細菌。

1.4內生拮抗細菌的鑒定

挑取純化兩次后干凈無污染的單菌落，與5uL無菌水混合，取1uL作為DNA模板，利用細菌16S rDNA基因通用引物，共30個循環；72℃延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5盆栽試驗

菌懸液的制備：挑取供試菌株DG3-1的單菌落接于LB液體培養基培養12h，5000r/mln離心10min，棄上清，加入適量無菌水，繼續離心，重復3次，最后一次加入無菌水，與沉淀混勻即為菌懸液。

每盆種4粒棉花種子，恒溫培養箱中培養；待棉花長出1～2片真葉時，處理組（DG3-1）用4mL配制好的根瘤菌DG3-1菌懸液灌根，對照組（CK）澆灌等量無菌水，6個重復；之后每7d灌根一次；21d后測量棉花株高、鮮重、干重以及葉綠素含量等指標。

葉綠素含量測定：準確稱取0.1g棉花葉片，用去離子水洗凈，吸干表面水分后放入具塞試管中；加入80%丙酮溶液，加塞搖勻后室溫下避光浸提48h；吸取葉綠素丙酮提取液2mL，加等體積80%丙酮稀釋后，測定663.2、646.8nm波長下的吸光值，以80%丙酮溶液為空白對照。葉綠素含量。

2結果與分析

2.1棉花不同組織內生細菌的分離

利用平皿組織分離法對棉花根、莖、葉中的內生細菌進行分離、純化。如圖1所示，2019年分離獲得16株內生細菌，根部、莖部、葉部分別獲得9、1、6株；2020年分離獲得15株內生細菌，根部、莖部、葉部分別獲得8、3、4株。可見棉花不同組織內生細菌的數量存在差異，根部相對較多。

2.2拮抗細菌對棉花黃萎病菌的抑制作用

從棉花不同組織中分離出31株內生細菌，通過平板對峙試驗篩選出11株對棉花黃萎病菌有拮抗作用（表1），相對抑菌率在35.99%～68.28%之間，有3株的相對抑菌率達到60%以上，具有開發為生防菌劑的潛力。部分拮抗效果見圖2。

2.3 拮抗細菌鑒定

利用細菌16SrDNA基因通用引物27F/1492R擴增目的菌株片段。PCR產物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在WD-9413B型凝膠成像分析儀系統中成像并拍照（圖3）。PCR產物測序結果使用NCBI網站的在線BLAST與GenBank中已提交的相似序列進行同源性比對。結果（表2）表明，具有拮抗效果的11株內生拮抗細菌基因片段長度在1286～1462bp。根部6株，其中，芽孢桿菌屬4株，編號為DGI-1、XGI-4、XG2-1、XG3-1，DGl-1菌株序列與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，登錄號MN543738.1）同源性100.00%，XGI-4與遲緩芽孢桿菌（Bacillus lentus，登錄號LS483476.1）同源性99.86%，XG2-1與蠟樣芽孢桿菌（登錄號FJ483513.1）同源性99.72%，XG3-1與解淀粉芽孢桿菌（Ba-cillLLS amyloliquefaciens，登錄號MK521053.1）同源性99.93%;根瘤菌屬2株，編號為DG3-1、XG4-（1），DG3-1與根瘤菌（Agrobacterium salini-tolerans，登錄號MK949137.1）同源性100.00%，XG4-（1）與根瘤菌（Rhizobium sp.，登錄號MK092996.1）同源性99.78%。莖部2株，均為芽孢桿菌屬，編號為DJ3-1、XJ1-1，其中，DJ3-1與解淀粉芽孢桿菌（登錄號JF460751.1）同源性99.86%、XJ1-1與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis，登錄號MN938176.1）同源性99.65%。葉部3株，均為芽孢桿菌屬，編號為DY3-1、DY3-2、XY3-（1），其中，DY3-1與蠟樣芽孢桿菌（登錄號MT974192.1）同源性99.86%，DY3-2與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，登錄號KF836534.1）同源性99.72%，XY3-（1）與蘇云金桿菌（BacillusthuringiensLs．登錄號MT492022.1）同源性99.93%。

2.4根瘤菌DG3-1對棉花生長的影響

盆栽試驗結果（表3）表明，與CK相比，使用DG3-1菌懸液灌根處理后棉花株高提高9.38%：地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重、地下部干重分別增加2.12、2.29、1.05、0.75倍；葉綠素含量提高1.75倍。表明DG3-1菌株對棉花生長有一定的促進作用。

3討論與結論

微生物防治是利用有益微生物或其代謝產物來防治和控制植物病害的方法，對植物和環境友好，分離和篩選新型的有益微生物是提高生物防治效果的有效途徑。本研究利用組織分離法對棉花不同組織內生細菌進行分離，發現內生細菌在棉花的根、莖、葉中普遍存在，且根部菌株數量最多，莖部最少，與羅明等的研究中棉花內生細菌數量在種子中最多，其次是根、莖、葉的分布規律有差異，可能與棉花的品種、生育期、樣本數量以及消毒方式等因素有關。

利用棉花內生菌防治棉花病害的優勢在于，內生菌存在于棉花組織中，占據有利于防治病害的生態位，且能順利定殖。棉花組織內有豐富的拮抗菌資源，已有多項研究報道棉花內生菌對棉花黃萎病菌有抑制活性或防治作用。周燚等從棉花維管束組織中分離出對棉花黃萎病有防治效果的解木聚糖類芽孢桿菌YUPP-1，經質粒標記發現其能在棉株中順利定殖：張瓊等從棉花根系分離得到的貝萊斯芽孢桿菌SZADI能顯著減輕棉花黃萎病的發生：張金鳳等從棉花根部分離出的解淀粉芽孢桿菌4IB-IR，不但能減輕棉花黃萎病的危害，還能有效提高棉花幼苗對棉花黃萎病的抗性。本研究篩選出11株對棉花黃萎病菌具有拮抗活性的菌株，經鑒定其中9株隸屬芽孢桿菌屬，2株屬根瘤菌屬，對棉花黃萎病菌的平板抑菌率在35.99～68.28%之間，其中有些菌株表現出較強的抑制活性，具有作為生防菌的潛力。然而內生拮抗菌在皿內試驗表現出良好的拮抗作用是不夠的，如何將微生物應用在大田中，且在田間試驗中仍表現出穩定的防病效果，以更好地應用于農業生產實踐，也是下一步的研究方向。

根瘤菌雖常與豆科植物共生，但也有研究表明其也能作為非豆科植物的根際有益菌促進植物生長。目前已有研究證明根瘤菌可在非豆科植物中定殖，且表現出明顯的促生作用。王平等通過外源標記基因特異性檢測技術測定華癸根瘤菌在水稻、小麥、油菜和棉花4種非豆科作物根圈的定殖能力，發現其不僅能在這4種植物根圈定殖，并且對棉花和油菜根系生長有一定影響，顯著促進水稻生長。本研究從棉花根部篩選鑒定出2株根瘤菌，其中菌株DG3-1對棉花黃萎病菌表現出較強的拮抗活性，抑菌率為（56.63+1.82）%，用DG3-1菌懸液并對棉花進行灌根處理后，棉株地上鮮重、地上干重、地下鮮重、地下干重、葉綠素含量均高于對照組，表明其具有一定的促生作用。本試驗僅測定了DG3-1對棉花部分生長指標的影響，其對棉花的促生能力，如何在棉株中定殖，以及相關促生機制還有待進一步研究。

綜上所述，本研究從棉花不同組織中分離獲得11株對棉花黃萎病菌具有抑制活性的菌株，其中9株為芽孢桿菌屬，2株為根瘤菌屬。根瘤菌DG3-1對棉花黃萎病菌具有較強的拮抗能力，并且對棉花的生長具有促進作用，兼具抑菌和促生能力，可為研發防治棉花黃萎病的生防制劑提供菌種資源。在棉花黃萎病的生物防治中，棉花內生菌有良好的應用前景，但要將生防菌株應用于實際生產，還要考慮到其是否能夠在棉株中穩定定殖、繁殖等因素，關于根瘤菌與非豆科植物的相互作用機理以及應用仍需進一步研究。