艾弗里的肺炎鏈球菌體外轉化實驗解析

摘要：艾弗里的肺炎鏈球菌體外轉化實驗是學生認識“DNA是主要的遺傳物質”的關鍵實驗之一。現行各版本高中生物學教材對該實驗的相關描述略有差別。本文從研究背景、設計思路、結果及推論、指向推論的新證據等方面梳理了該實驗的研究過程，以進一步體會本實驗之精巧。

關鍵詞：艾弗里；肺炎鏈球菌；體外轉化實驗；研究過程

文章編號：1003-7586（2024）03-0061-03 中圖分類號：G633.91 文獻標識碼：B

艾弗里的肺炎鏈球菌體外轉化實驗是遺傳物質發現史上的經典實驗之一，也是“DNA是主要的遺傳物質”的重難點內容。現行各個版本的高中生物學教材均重點介紹了這一實驗，但在描述該實驗的具體內容上略有差別。人教版、北師大版、滬科教版教材提及艾弗里對制備的S型菌細胞提取物進行酶學檢測，而浙科版、滬科版、蘇教版教材則指出艾弗里是逐一分離出S型菌所含的物質進行鑒定。此外，多版教材提到因為DNA純度沒有達到100%而導致該實驗結論受到學界質疑。這不禁讓人疑惑，艾弗里究竟是如何設計肺炎鏈球菌體外轉化實驗并得出結論的？當其他人質疑實驗不嚴謹時，他是否展開進一步的研究？為理清這些問題，回溯艾弗里團隊當時的真實研究至關重要。

1 肺炎鏈球菌體外轉化實驗的研究背景

20世紀初，由于大葉性肺炎的迅速傳播與高致死率，科學家們開始致力于肺炎鏈球菌的免疫學研究。1928年，格里菲斯的實驗結果震驚了學界，他發現在加熱殺死的S型菌作用下，活的R型菌能在小鼠體內轉化為活的S型菌。臨床上需要不同類型的肺炎鏈球菌保持遺傳性穩定，才能開發血清治療方案針對特定肺炎鏈球菌。顯然，不同類型肺炎鏈球菌的轉化導致治療前景并不樂觀，還需進一步探尋其轉化機制。

艾弗里敏銳地意識到引起轉化的可能是加熱殺死的S型菌中的某種物質（以下稱“轉化因子”），但其化學本質仍是未知。值得注意的是，“轉化因子”一度被人產認為是蛋白質。但艾弗里并未受此束縛，而是不斷嘗試肺炎鏈球菌的體外轉化，以此深入挖掘“轉化因子”化學本質的相關事實與證據。

2 肺炎鏈球菌體外轉化實驗的設計思路

當時人們已經認識到，S型肺炎鏈球菌中含蛋白質、多糖、脂質、RNA、DNA等成分，而這些成分都可能是“轉化因子”。判別的主要思路有兩種：第一，從S型菌細胞粗提取物中除去某種成分，檢測轉化活性是否損失，若損失很少，則被除去的成分不是“轉化因子”；第二，分離純化出具有轉化活性的成分，并對其性質進行鑒定。艾弗里團隊首先基于第一種思路排除了蛋白質、多糖、RNA、脂質作為“轉化因子”的可能性，而后沿第二種思路尋找到DNA是“轉化因子”的多重證據。

3 肺炎鏈球菌體外轉化實驗的結果及推論

3.1 揭示RNA、蛋白質、多糖、脂質不是“轉化因子”

結果一：提取物經純化后，轉化活性損失很少。

要分離活性物質，必須對細胞粗提取物進行純化，純化涉及4個關鍵步驟：鈣醇沉淀、超速離心、加熱、鹽水洗滌。這些步驟帶走了大量的RNA、蛋白質、多糖，但轉化活性的損失卻不超過10%～15%。

推論一：RNA、蛋白質、多糖不是轉化因子。

細胞粗提取物中大量的RNA、蛋白質、多糖被除去。若它們是“轉化因子”，則純化后提取物的轉化活性也應而事實上并未如此，所以上述成分不大大降低是“轉化因子”的可能性。

純化后的提取物中并非完全不含這些成分，或許只需微量的某種成分便能促使轉化發生。因此，必須找到更有說服力的證據。艾弗里繼續對純化后的提取物進行定性、定量檢測和酶解，提供了更完整的證據。

結果二：純化后提取物的雙縮脲反應、米倫反應均呈陰性。

推論二：純化后提取物中幾乎不含蛋白質。

雙縮脲反應和米倫反應都能定性檢測蛋白質，結果是兩個反應均呈陰性，可推斷純化后的提取物中已幾乎不含蛋白質。但嚴格來講，定性反應的說服力仍不足以應對質疑，須有更精準的方法。

結果三：提取物的轉化活性幾乎不會隨RNA、蛋白質、多糖、脂質的損失而損失。

艾弗里團隊使用了核糖核酸酶、蛋白酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶）、多糖水解酶、酯酶一一分解提取物中的RNA、蛋白質、多糖和脂質，并利用透析除去酶解產生的小分子物質。最后通過滴定檢測提取物的轉化活性，以檢驗這些成分的損失對轉化活性的影響。結果顯示，提取物的轉化活性幾乎不會隨這些成分的損失而損失。

推論三：進一步明確RNA、蛋白質、多糖、脂質不是“轉化因子”。

相較于定性檢測，酶解法能更徹底地除去提取物中的上述成分，使之幾乎不含這些成分。如，雙縮脲反應不能檢測到二肽，米倫反應無法檢測到不含酪氨酸的蛋白質，而當時不知道提取物中究竟有哪些蛋白質或含有無法被雙縮脲反應和米倫反應測到的蛋白質。但酶解法利用了實驗設計中常用的“減法原理”，無需明確蛋白質的種類和含量，轉而將其統一水解為氨基酸并除去。在當時提純技術有限的情況下，艾弗里團隊通過這種方式，巧妙地將純化后提取物中RNA、蛋白質、多糖和脂質的含量控制在相當低的水平，基本上說明這些成分不是肺炎鏈球菌發生轉化的關鍵物質。

3.2 揭示DNA是“轉化因子”的基本單位

多重證據：定性化學分析、元素化學分析、理化性質分析、酶學分析、生物活性測定。

在方法學層面，他們幾乎獲得了純凈的、具有轉化活性的“轉化因子”。接下來便是對其化學性質進行鑒定。艾弗里掌握了5個來源的數據，為DNA是“轉化因子”的基本單位提供了充分且多元的證據，如表1所示。

推論：DNA是“轉化因子”的基本單位。

定性化學分析：揭示純化制劑中含DNA的第一個證據是其對二苯胺反應呈陽性。用酸處理純化制劑，其中除去嘌呤核苷酸的脫氧核糖在乙醛存在下可與二苯胺反應，呈現藍色。

元素化學分析：對具轉化活性的純化制劑進行氮、磷、碳、氫含量分析，其氮磷比的變化范圍為1. 58～1. 75，平均值為1.67，與脫氧核糖核酸鈉的理論值（氮磷比為1.69）十分接近。雖然這一數據本身并不能證明純化制劑的活性成分是一種化學實體，但它至少能說明其中幾乎不含蛋白質等含磷或氮的雜質，否則氮磷比會發生顯著改變。

理化性質分析：純化制劑與已知的DNA制劑的理化性質也高度一致。如，其在電場和離心場中的活動、吸收紫外光的最大波長和最小波長區與DNA制劑相同；該分子大小均勻、非常不對稱，其沉降速率和幾種DNA制劑也非常一致。

酶學分析：向純化制劑中加入動物來源（主要是犬、兔）的血清等粗酶制劑，發現含能將脫氧核糖核酸解聚的酶（以下簡稱DNA酶）的添加物，才能使“轉化因子”失活。反之，一旦血清中的DNA酶完全失活，純化制劑中的“轉化因子”便不受影響，轉化仍能發生，可以初步推定純化制劑中的活性成分是DNA。根據對照實驗的思想，若血清中的DNA酶作用于已知的DNA制劑也表現出相似規律，則可以提供更完整的證據。因此，艾弗里團隊用同樣的犬、兔血清（含DNA酶）在米爾斯基制備的脫氧核糖核酸鈉（人工合成的DNA制劑）上進行了酶活性測試，結果顯示兩種情況下酶的失活溫度存在明顯的平行性。此外，一定濃度的氟化物不僅能抑制純化制劑中DNA的酶解，也會抑制人工合成的DNA制劑的酶解。綜上，相關酶在相同的溫度下失活并被氟化物抑制，為DNA是“轉化因子”的基本單位提供了額外證據。

生物活性測定：高度純化的提取物經過了不同等級的稀釋（10-2、10-2. 5、10-3、10-3. 5、10-4、10-4. 5），仍能使活的R型菌轉化為活的S型菌。

4 證實肺炎鏈球菌體外轉化實驗推論的新證據

1944年，艾弗里團隊對“轉化因子”的研究成果一經問世，便受到學界的諸多質疑。但他們從未停止探索的腳步，持續展開更深入的研究以證實推論的可靠性。

質疑主要源于DNA的純度，所謂“純凈、無蛋白質的”DNA制劑中仍存在1%或2%的蛋白質，但利用元素化學分析無法檢測出蛋白質的存在。因此，他們的研究突破點是如何獲得令人信服的證據，證明是DNA本身而不是摻雜的蛋白質具備轉化活性。但受限于當時的提純技術，他們無法完全除去蛋白質，于是他們轉換研究視角，尋找不涉及純度問題的替代方法，以此充分驗證純化制劑中的DNA才是“轉化因子”。繼承酶解思路，若能獲得特征明確的DNA酶，在分解DNA的同時還能顯示出“轉化因子”的轉化活性遭破壞，則能完成驗證。

在這種思路的啟發下，他們成功從牛胰腺中分離、純化出DNA酶，該酶制劑具備兩個明確特征。第一，它需要Mg2+或Mn2+激活才具備分解DNA的活性；第二，檸檬酸鈉能束縛Mg2+的游離而Mn2+不受影響。綜合兩個特征，檸檬酸鈉的存在抑制了由Mg2+激活的酶，使之不能分解DNA，但由Mn2+激活的酶不受影響，仍能分解DNA。

基于此，若在“轉化因子”的酶解實驗中也存在相同模式，則能證明是激活的DNA酶本身能破壞“轉化因子”的轉化活性。由于酶解的特異性，不難得出DNA即為“轉化因子”。因此，他們進一步研究檸檬酸鈉存在時，Mg2+或Mn2+作用下DNA酶對“轉化因子”活性的影響。結果發現，與DNA酶分解DNA情況一致，DNA酶破壞“轉化因子”也存在相同的酶激活條件和抑制條件。綜上，檸檬酸鈉和金屬離子的存在確保了DNA酶本身在同時作用或同時不作用于DNA和“轉化因子”，如圖1所示。此外，激活后極低濃度的DNA酶便能完全破壞“轉化因子”的轉化活性。至此，艾弗里才堅定地提出結論：DNA就是“轉化因子”。

5 結語

肺炎鏈球菌體外轉化實驗中，研究人員在一系列實驗證據的基礎上，一步步嚴謹地從推論走向可靠的科學結論。本實驗也見證了艾弗里對DNA作用的革命性發現，通過對肺炎鏈球菌“轉化因子”的研究，更多的人開始重新思考DNA作為遺傳物質的可能性，并展開DNA的結構、遺傳的分子機制等相關研究。